Microbiología APLICADA

Norovirus Clostridium perfringens Staphylococcus aureus

Campylobacter
Janneth Gallegos Núñez
MSc. PhD
 UNIDAD 1
• Objetivo. saber los usos benéficos de los
microorganismos, así como la problemática
asociada a la contaminación microbiana de los
alimentos mediante la identificación de la
actividad microbiana y sus efectos sobre la
matriz alimentaria o el consumidor a fin de
conocer cómo se controlan estos agentes para
garantizar la inocuidad de los productos.
Tema: Alcance de la Microbiología aplicada

Subtemas
• Ámbito de estudio
• Fuentes de microorganismos
• Problemas de la contaminación microbiana
• Introducción al análisis microbiológico
Ámbito de estudio de la Microbiología Aplicada

Antecedentes
• En la recolección y caza hubo consciencia de la
descomposición.
• Hacia 8000, a. C aparecen la agricultura y ganadería
• Fue importante la conservación
• Entre 8000 y 1000 a. C. se usan: deshidratación,
cocción, horneado, ahumado, salado, uso del azúcar,
hielo, fosas, fermentación, encurtido, condimentado.
• Se conocía el nexo alimento-enfermedad?
• Hay evidencias (textos religiosos) de
prohibiciones sobre no comer carne de
animales enfermos, o manipulados por
personas no limpias.

• Se usa la fermentación como medio de

conservación para producir otros varios tipos
de alimentos
• Después de estudios de Leeuwnhoek (1670)
• Se empieza a relacionar la función de los mo en la
descomposición de alimentos, fermentación y
enfermedades
• Pasteur desarrolla pruebas científicas en 1870
• Siguieron otros experimentos a finales del siglo 19
• La Microbiología de alimentos se establece en el
siglo XX
 ESTADO ACTUAL
• A principios del siglo XX, fue importante la
asociación bacterias patógenas-alimentos
• Métodos: aislamiento/identificación
• Higiene en el manejo de los alimentos
• Métodos para evitar la multiplicación y para
destruir bacterias alterantes y patógenas
• Aislar/caracterizar bacterias benéficas
• Después de 1950: nueva era
Información:
• Biología, Fisiología, bioquímica,(alimentos)
• Interacción microorganismo-ambiente
• Fisiología, bioquímica, genética, inmunología
microbiana

NUEVAS FRONTERAS
 1.Fermentación de los alimentos
• Desarrollo de cepas deseables (transferencia
genética)
• Desarrollo de BAL (resistentes a bacteriófagos)
• Ingeniería de cepas (sobreproducción de
metabolitos)
• Secuenciación de genomas (BAL)
• Bioconservación
• Comprensión de bacterias probióticas
• Desarrollo de cultivos iniciadores (uso directo)
2.Descomposición de los alimentos
• Identificación y control de nuevas bacterias (por
cambios en el procesamiento)
• Descomposición debida a enzimas (alimentos
congelados/refrigerados)
• Desarrollo de nanotecnología (metabolitos de
bacterias de descomposición y predecir la vida útil)
• Resistencia de las bacterias a los conservadores
antimicrobianos por efecto de la presión ambiental
3. Enfermedades de origen alimentario
• Métodos de detección de patógenos emergentes
• Detección rápida de patógenos en alimentos y
ambientes
• Detección efectiva y métodos de control de virus
de origen alimentario
• Transmisión de enfermedades por priones
• Efecto de la presión ambiental sobre la detección
y destrucción de patógenos
• Patógenos resistentes a antibióticos en los
alimentos
• Adherencia de patógenos sobre la comida y
superficies
• Mecanismos de patogenicidad
• Efecto del estrés (alimentos o ambiente) sobre
la regulación de genes, patogenicidad y
supervivencia
• Métodos para estudios epidemiológicos
• Control de los parásitos patógenos
 Otros aspectos
• HACCP en la producción, procesamiento y
conservación
• Nuevas tecnologías
• Microbiología de alimentos listos para comer
• Control de alimentos del campo a la mesa
• Legislación sobre seguridad alimentaria
Más allá de ciencia aplicada que participa en el control de la calidad

• la tecnología de producción, procesamiento,

distribución, comercialización, patrones de
consumo han cambiado.
• Los cambios han introducido problemas
Hace falta conocer

ecología, fisiología, metabolismo,

genética
 SE DEBE CONOCER
• Calidad microbiológica (alimentos,
ingredientes) usando técnicas adecuadas
• Determinar agentes de alteración y riesgos de
enfermedad. Identificar las fuentes
• Entender mecanismos de patogenicidad
• Diseñar procedimientos correctivos para
controlar microorganismos de alteración y
patógenos
• Métodos rápidos para aislar e identificar mo
• Diseñar métodos para resolver problemas
microbiológicos específicos ocasionados por
nuevas tecnologías.
• Diseñar procedimientos de sanitización
• Uso de microorganismos deseables para
producir alimentos fermentados
• Producción de cultivos iniciadores
• Conocimiento de las normas relacionadas con
los alimentos.
• Problemas de alimentos importados
 Efectos de los microorganismos en
los alimentos
Ubicuidad ALIMENTOS Ambiente
microbiana

Microbiota indígena Microbiota alóctona

CAMBIOS DESEABLES

Microorganismos
Alteración
patógenos/Metabolitos
FERMENTACIONES
contaminación

ETA
PÉRDIDAS
LOS ALIMENTOS COMO ECOSISTEMAS

MICROBIOTA AMBIENTE
ALIMENTO

CRECIMIENTO MUERTE SUPERVIVENCIA

 Como atenuar la problemática?
• Gestión de la calidad e inocuidad alimentaria
• Marco de prioridades del pais 2013-2017
LA INDUSTRIA DEBE MÉTODOS DE
CONOCER ANÁLISIS

LA CALIDAD DE

 MATERIA EMITIR DICTÁMENES

PRIMA
CALIDAD
 PROCESO
SEGURIDAD
 PRODUCTO
FINAL
 EL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO

HERRAMIENTA BÁSICA

 MATERIA PRIMA

 PROCESO

 PRODUCTO FINAL

 MANIPULADORES
 AMBIENTE

GRADO DE CONTAMINACIÓN
BIOLÓGICA
 OBJETIVOS DEL ANÁLISIS
MICROBIOLÓGICO
 Asegurar que el alimento cumpla con la
norma

 Que se ajuste a la norma que exige la

empresa y el comprador.

 Que la materia prima cumpla con la

norma exigida y pactada con el
productor

 Que se mantenga el control del

proceso y la higiene en la línea de
producción
 GESTIÓN DE INOCUIDAD
ES NECESARIO
1. INSPECCIÓN O VIGILANCIA • Calidad sanitaria: ausencia
2. ACCIONES Y MEDIDAS
PARA CONSEGUIR
relativa de patógenos.
ALIMENTOS SEGUROS • Calidad higiénica
CAMPO MESA
• Microbiología del agua
 VIGILANCIA O COMPROBACIÓN
MICROBIOLÓGICA
PARÁMETROS

 MUESTREO

 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS

 TÉCNICAS ANALÍTICAS

 VALORES DE REFERENCIA (NORMAS MICROBIOLÓGICAS)

 ELECCIÓN DE MÉTODOS Y MEDIOS ANALITICOS

 ALIMENTO

LOS MÉTODOS
SON MUY
VARIADOS
 NUMEROSAS TÉCNICAS

Menor número de procedimientos y ensayos

 Métodos inmunoenzimáticos
 Impedancia
 Separación inmunomagnética
 Bioluminiscencia del ATP
 PCR
 Técnicas de recuento en placa: Petrifilm, Ridacult
 Medios cromogénicos
 Medios fluorogénicos
 Dipslides
 EJEMPLOS DE INNOVACIONES
PROCEDIMIENTO EQUIPO
Preparación de homogeneizados Stomacher
Pulsifier
Preparación de diluciones
Para muestras sólidas: Dilutores gravimétricos
(Dilumat, AES Chemunex; Dilumacher, PBI; Labpro
Gravimetric Diluter, Spiral Biotech).

Para muestras líquidas: Sistema Dilucup, LabRobots Products AB

Para muestras de superficie: Esponjas prehidratadas con un medio de transporte o
enriquecimiento, diseñadas para obtener muestras de
lugares de difícil acceso (SpongeSicle y Extend-aSicle,
Biotrace International) y

Manos libres Cinta adhesiva

 • Ondas de choque
• Intensa agitación
• Mínima destrucción
de la muestra

PULSIFIER

http://microgenbioproducts.com/pulsifier-a-
revolution-in-microbiological-test-sample-
preparation/#
Dilutor gravimétrico
PROCEDIMIENTO
Muestras de aire
Preparación
Distribución de medios de cultivo
Medios de cultivo
Medios de cultivo cromogénicos
Métodos de siembra
Recuento de colonias
TODAS LAS OPERACIONES
EQUIPO
SAS sampler, Bioscience International; MicroBio Air
Sampler, Parrett
Sistemas automatizados
(Masterclave, AES Chemunex);
Pectina (Redigel, 3M)
Petrifilm
(RAPID´ Chromogenic Methods, Bio-Rad; BBL
CHROMagar, BD; medios cromogénicos bioMérieux;
medios cromogénicos AES Chemunex)
Sembradores en espiral. (Autoplate 4000, Spiral
Biotech; WASP, Don Whitley Scientific Limited) y
Contadores automáticos. (Q Count, Spiral Biotech;
EasyCount2, AES Chemunex). C
Sistema automático
Siembra en espiral
 RECUENTO DE CÉLULAS VIABLES
Determinación Innovación
Enumeración de microorganismos Isogrid, Neogrid (NEOGEN)
NMP Amplio rango de enumeración sin diluciones
Membrana con 1600 compartimentos
Simplate Permite contar 738 UFC
NMP Tarjetas con pocillos
Colilert 18 Idexx 3grupos de 16 pocillos
Medios fluorescentes
Tempo, Biomerioux
Doble tubo de Fung para anaerobios Se evita el uso de generadores de H2 y jarras o
cámaras de anaerobiosis
Recuentos en tiempo real Usa colorantes fluorescentes
diferencia células vivas de muertas DEFT (Direct epifluorescent filter technique)
mediante el microscopio
Recuento en tiempo real Usa citometría de flujo. (BactiFlow ALS, AES
Chemunex)
 MEDIDA DE LA BIOMASA MICROBIANA
Determinación Innovación
ATP En un luminómetro se mide la luz emitida por bioluminiscencia. La
En menos de 1 cantidad de ATP es directamente proporcional al número de células vivas
min UFC= 0,22 a 1,03 fg de ATP. (Ultrasnap y systemSURE Plus, Hygiena;
Accupoint, Neogen; Lightning MVP, Biocontrol; CleanTrace y Uni-Lite, 3M
Detección rápida Los nutrientes reaccionan con los reactivos presentes en hisopos
de restos de especiales, y se origina un cambio de color (reacción semicuantitativa)
proteínas o que se detecta visualmente (PROTECT, Biotrace International; PROClean y
azúcares en las SpotCheck plus, Hygiena; Clean Test, LiofilChem)
superficies
Listeria spp Escobillones con antibióticos, sustancias enriquecedoras del crecimiento
y compuestos indicadores que cambian de color en aproximadamente 30
h en caso de un resultado positivo (InSite, Hygiena; Listeria superficies
PDX-LIB/Enviroswab, Paradigm Diagnostics/Tecra).
Monitoreo de la Los cambios de color del medio de cultivo se relacionan con la actividad
actividad metabólica microbiana , se pueden obtener resultados en pocas horas
metabólica (BacT/Alert 3D, bioMérieux; Soleris, Neogen).
Determinación Innovación
Estimación de la El metabolismo de nutrientes de gran tamaño a moléculas de menor
población inicial tamaño y químicamente más activas durante el crecimiento microbiano
a partir del produce cambios en la conductividad eléctrica y resistencia del medio. Los
tiempo en que cambios son detectables cuando la población es crítica 106(Bactometer,
ocurre el cambio bioMérieux; RABIT, Don Whitley Scientific Limited).
metabólico
SISTEMAS MINIATURIZADOS Y KITS DIAGNÓSTICOS
DETERMINACIÓN
Identificación sencilla de colonias
sospechosas mediante pruebas
bioquímicas rápidas.
Identificación bioquímica de más de
800 especies de bacterias y
levaduras
Identificación bacteriana mediante
tubos de plástico
Identificación bacteriana
Soportes plásticos con pocillos
INNOVACIÓN
Tarjetas desechables con sustratos definidos que van a
usar los microorganismos. (O.B.I.S., Oxoid);
Galerías (API, bioMérieux)
Los tubos con compartimentos contienen agar con
distintos sustratos y con una aguja en su interior que
posibilita la inoculación del tubo de forma rápida y
sencilla a partir de una única colonia (BBL Enterotube y
Oxi/Ferm Tube, BD)
Pocillos de fácil inoculación contienen sustratos
cromogénicos y/o fluorogénicos en estado deshidratado
que se rehidratan en contacto con la muestra (BBL
Crystal, BD; RapID systems y MicroID, Remel;
Biochemical ID systems, Microgen).
DETERMINACIÓN
Identificación bacteriana
Identificación y establecimiento de
relaciones filogenéticas entre
distintos aislados.
INNOVACIÓN
Una tarjeta plástica con pocillos contiene los sustratos
bioquímicos en forma deshidratada que permiten
identificar un cultivo típico de Escherichia coli en 2-4 h
en base a cambios de color de los sustratos o en la
producción de gas de los cultivos inoculados.
El sistema Biolog (AES Chemunex) detecta la capacidad
de los microorganismos para oxidar 95 fuentes de
carbono. Los 295 (4x1028) patrones metabólicos posibles
permiten establecer relaciones filogenéticas
 Métodos inmunológicos
Determinación
Detección de microorganismos o
sus toxinas
Salmonella, E. coli O157:H7, Listeria
monocytogenes, Campylobacter spp.
y toxinas estafilocócicas
Innovación
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) tipo
sándwich. (Assurance EIA y TRANSIA PLATE,
Biocontrol; TECRA VIA, Biotrace International;
Salmonella UNIQUE, Tecra; Detex, Molecular Circuitry
Inc.).

Detección de patógenos alimentarios ELFA. Variante de ELISA. Producto final fluorescente

Concentración del antígeno de
interés
Serovares mótiles de Salmonella
VIDAS
SIM (Separación inmunomagnética). Emplea
partículas magnéticas revestidas de anticuerpos.
(Dynabeads, Dynal),
Inmunodifusión en un vial de agar
 GRUPOS DE MÉTODOS RÁPIDOS

• Medición de células viables

• Medición de biomasa
• Sistemas miniaturizados
• Kit de diagnóstico, Inmunológicos
• Genéticos
VENTAJAS DE LOS MÉTODOS RÁPIDOS

• Tiempo reducido para la obtención de los resultados

y/o permiten procesar un número elevado de
muestras por unidad de tiempo
• En general, son fáciles de usar.
• Precisos (sensibilidad y especificidad adecuadas y
límites de detección bajos)
• Económicamente rentables
 Limitaciones de los métodos rápidos

• Elevada inversión inicial

• El uso de métodos rápidos no excluye la fase
de enriquecimiento.
• Ni obtener el cultivo puro del microorganismo
diana
• Los resultados deben ser confirmados