PENGARAHAN TES BIOKIMIA

PRINSIP DAN PENGGUNAAN

LIA DAN MIO

Linny Luciana
P e m b i m b i n g : d r. J u l y K u m a l a w a t i , D M M , S p P K ( K )
Pe n g a r a h a n
Te s B i o k i m i a
PENGARAHAN TES BIOKIMIA

• Berdasarkan morfologi koloni dan karakteristik

pewarnaan Gram, prosedur biokimia tambahan
diperlukan
• Hasil pemeriksaan biokimia digunakan untuk
identifikasi akhir dari isolate
PENGUNAAN KARBOHIDRAT
• Bakteri mengunakan karbohidrat jika mereka memerlukan
enzim spesifik untuk memecah karbohidrat.
• Pemecahan karbohidrat yang terjadi dalam susasana tanpa
oksigen disebut fermentasi dan akan menghasilkan gas
• Organisme yang menggunakan karbohidrat saat ada oksigen
disebut sebagai oksidase
• Media yang dipakai mengandung satu atau lebih karbohidrat
dengan indicator asam dan basa
LANJUTAN
• Jika karbohidrat digunakan maka indikator akan berubah dari
netral menjadi asam ----reaksi positif

• Contoh:
Media berisi phenol red sebagai indikator. Setelah inokulasi
dan inkubasi, perubahan warna dari merah pink menjadi
kuning ---reaksi positif.
Gelembung atau pemecahan media mengindikasikan produksi
gas

• Karbohidrat yang sering diperiksa adalah glukosa, laktosa,

maltose, sukrosa, dan fruktosa
• Reaksi fermentasi dapat dilihat di bagian bawah dari tabung,
KATALASE
• Banyak mikroorganisme memproduksi oksigen radikal,
termasuk hydrogen peroksida yang dapat menghancurkan
sel

• Enzim katalase digunakan untuk memecah hydrogen

peroksida menjadi air dan molekul oksigen

• Produksi katalase ini membuat bakteri bertahan dalam dalam

tubuh host

• Bakteri yang memproduksi katalase : Staphylococcus

species, Listeria monocytogenes, Bacillus species, dan
OKSIDASE
• Bakteri yang mempunyai enzim sitokrom oksidase dapat
mentransfer electron dari oksigen melalui system respirasi aerob
bakteri

• Sitokrom oksidase pada atmosfir oksigen mengoksidase

tetramethyl-para-phenylenediamine dihydrochloride (reagen
oksidase untuk membentuk warna-indophenol.

• Sitokrom ditemukan pada Neisseria, Aeromonas, Pseudomonas,

Campylobacter, Pasteurella tetapi tidak pada Enterobacteriaceae
KOAGULASE

• Fibrinogen mengubah fibrin jika terdapat enzim

koagulase

• Staphylococcus aureus memproduksi enzyme koagulase

baik yang terikat maupun bebas
SPOT INDOLE
• Enzim triptophanase mendegradasi asam amino
triptofan menjadi indole, ammonia, dan asam piruvat
• Untuk melihat bakteri yan dapat tumbuh pada media
yang mengandung triptofan.

• Tes ini sangat penting untuk mengidentifikasi

Escherichia coli yang merupakan anggota dari
Enterobacter yang memberikan hasil indole positif
• Reaksi indole positif juga untuk membedakan jenis
Proteus sp. Proteus Vulgaris memberikan hasil indole
positif
Prinsip dan Penggunaan
LIA DAN MIO
PRINSIP LIA DAN MIO

• Identifikasi organisme berdasarkan kemampuan menghasilkan enzim

untuk dekarboksilasi asam amino menjadi amina dengan sifat alkali

• Uji dekarboksilase:
– Lysine
– Ornithine
– Arginine
• LIA: Lysine Iron Agar
• MIO: Motility Indole Ornithine
DEKARBOKSILASI

• Enzim dekarboksilase bakteri memotong gugus karboksil (=COOH) dari asam

amino menghasilkan amina atau di-amina dan karbon dioksida

• Enzim dekarboksilase:
• 1. Spesifik substrat tertentu: lysine, ornithine, arginine
• 2. Produksi adaptif, diinduksi oleh suasana asam dan adanya substrat spesifik
• 3. Substrat harus mengandung setidaknya 1 senyawa aktif selain amina (NH2)
dan karboksil (COOH)
• 4. Terjadi dalam keadaan anaerob (nonoksidatif)
• 5. Ireversibel
• 6. Membutuhkan koenzim piridoksal fosfat  meningkatkan aktivitas
dekarboksilase
3 ENZIM DEKARBOKSILASE PENTING
UNTUK IDENTIFIKASI BAKTERI
• Lysine  menghasilkan cadaverine
• Ornithine  menghasilkan putrescine
• Arginine  menghasilkan citrulline

• Dekarboksilase lemah  ekstraksi amina dengan kloroform 

deteksi dengan reagen Ninhidrin
• Aktivitas dekarboksilase Enterobacteriaceae dideteksi dengan:
broth dekarboksilase Moller, Falkow lysine broth, MIO, LIA
 LIA
LYSINE IRON AGAR
 KOMPOSISI LIA
• Media dasar Edward-Fife, berdasar formula Falkow
• L-lysine 0.1 %
• Glucose 0.1 %
• Indikator H2S :
- Ferric ammonium citrate
- Sodium thiosulfat
• Indikator pH : bromcresol purple
asam : pH 5.2  warna kuning
basa : pH 6.8  warna ungu
• Dibuat pada pH 6.7 + 0.2

MacFaddin JF. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. 3 rd Ed.

Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2000.p.120-30.
 FALKOW’S LYSINE DECARBOXYLASE
BROTH
• Pepton 5 g
Pemanasan untuk
• Yeast extract 3 g
melarutkan, 4-5 mL per
• Glukosa 1g
tabung ulir
• L-Lysine 5 g (separuh
konsentrasi dasar Moeller) Sterilisasi 121oC, 15
• BCP 0.02 g menit, 15 psi
• Air deionisasi 1000 mL
 KOMPOSISI LIA DI RSCM
(OXOID : CM 381)
Formula g/L Keterangan
Bacteriological peptone 5.0
Yeast extract 3.0
Glucose 1.0
L-lysine 10.0
Ferric ammonium 0.5 Indikator H2S
citrate
Sodium thiosulphate 0.04 Donor sulfur
Bromcresol purple 0.02 Indikator pH
Agar 14.5
pH 6.7 + 0.2
H2S akan bergabung dengan Ferric ammonium sitrat untuk
membentuk Ferric sulfida yang berwarna hitam.
MacFaddin JF. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. 3 rd Ed.
Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2000.p.120-30.
PEMBUATAN LIA

1. Campur 34 gram bubuk agar dengan 1 liter akuades.

2. Dipanaskan sampai larut dengan sempurna.
3. Larutan dituang ke tabung – tabung kecil (+ 3 mL) dan tutup dengan kapas lemak.
4. Sterilkan dengan autoklaf 121O C selama 15 menit.
5. Setelah steril, tabung dimiringkan sehingga terbentuk slant dan butt.

MacFaddin JF. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. 3 rd Ed.

Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2000.p.120-30.
CARA INOKULASI

- Gunakan jarum inokulasi, light inoculum

- Tusuk bagian butt hingga ¼ inch dari dasar tabung
- Gunakan loop ‘fishtail slant’
- Gores bagian slant
- Inkubasi 350C selama 18 – 24 jam
- Disarankan tutup dengan 2-3 mL paraffin oil steril

MacFaddin JF. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. 3 rd Ed.

Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2000.p.120-30.
LYSINE IRON AGAR

• Media padat
• Membedakan Enterobacteriaceae berdasarkan kemampuan dekarboksilasi
atau deaminasi lisin, serta kemampuan menghasilkan H2S
• Metode sama dengan Falkow
• Skrining pathogen fekal dan identifikasi Salmonella spp.
• Volume 4 mL, deep butt (untuk anaerob) / short slant
• Metode inokulasi streak dan stab (2x)
• Inkubasi 18-24 jam di 35oC
DEKARBOKSILASE LYSINE
• LIA
• Media solid dekarboksilase lisin berdasar formula
Falkow  mengandung ferric ammonium citrate
dan thiosulfate untuk mendeteksi H2S
• Membantu identifikasi Salmonella  positif H2S
(deep hitam) dan dekarboksilase lisin positif
(slant ungu)
• Proteus dan Providencia tidak dekarboksilasi,
tapi deaminasi asam amino  warna merah di
slant
• Bermanfaat membedakan Citrobacter (0% pos)
dari Salmonella (98% pos)
DEKARBOKSILASE LYSINE

• Biokimia dan precautions sama dengan media Falkow atau Moeller

• Positif:
– Slant ungu / butt ungu (alkali), dengan atau tanpa H 2S
– Reaksi butt bisa ditutupi warna hitam H2S
– H2S hanya diproduksi di lingkungan alkali dan secara anaerob di butt
• Negatif:
– Slant ungu / butt kuning (acid)
– Hanya memfermentasi glukosa
DEAMINASE LYSINE
DEAMINASE LYSINE

• 1. Slant merah / butt kuning

– Reaksi slant khas Proteus dan Providencia
– Reaksi butt akibat fermentasi glukosa
• 2. Proteus yang memproduksi H2S tidak menghitamkan media
• 3. Reaksi slant dengan M.morganii biogrup 2 bervariasi sesudah inkubasi 24 jam

• Tanpa penambahan indicator pH, Proteus dan Providencia menghasilkan warna

oranye di seluruh media karena deaminasi lisin. Produk ini bergabung dengan
indicator pH BCP menjadi warna merah di slant (aerob)  masih tidak diketahui
senyawa mana yang membentuk warna merah
 • Kemampuan bakteri melepaskan sulfur dari asam

PRODUKSI H 2 S
amino atau senyawa lain untuk membentuk H 2S 
penting untuk identifikasi
• Asam amino mengandung S: pepton, cysteine,
cystine, methionine, thiosulfate
• Media yang umum digunakan antara lain:
PRODUKSI H 2 S

• 1. Sulfida dilepaskan dari cysteine atau thiosulfate melalui proses enzimatik

• 2. Menggabungkan sulfide (S2-) dengan ion hydrogen (H+) menjadi H2S

• 3. Deteksi H2S menggunakan besi, bismuth atau timbal  membentuk

sulfide logam berat yang tampak sebagai presipitat berwarna hitam
TUJUAN PEMERIKSAAN LIA
Membedakan
Membedakan
Spesies
Genus Pseudomo Burkholderi
Enterobacter nas Klebsiella a
Pos Neg Pos Neg Pos Neg Var Pos Neg
Edwardsiella dan
Salmonella (+)
Ha Pa
dari Citrobacter fni nt K.p
spp. (-) a En oe K.pn neu B
al ter a P.p eum mo .
ve ob ag se Kle onia nia g
E.Coli (+) dari E. E. Ha i ac gl ud Pse bsi subs e l
Shigella spp.(-) ae ge fni bi ter o oal udo ella p. sub a
ro rg a og sp m cal mo spp Rhin sp. d B. B.ps
ge ov al ro p. er P.ce ige nas . oscle Oza B.c i m eud
ne ia ve up La an paci ne spp. Lai roma ena epa o all oma
s e i 1 in s a s Lain n tis e cia li ei llei
 LIA
Kiri: Deaminasi lysine menghasilkan slant merah
dengan butt kuning (asam)
Kiri: Bakteri menghasilkan H2S dengan warna
kehitaman di bagian tengah dan butt
Tengah: Dekarboksilase lysine: warna ungu
(alkali) di butt
Kanan: negative deaminase dan dekarboksilase,
butt kemerahan tapi tidak kuning
 INTERPRETASI
1. Dekarboksilasi Lisin (Anaerobik)
Hasil Slant/Butt Keterangan
Reaks
i
Positif +/+ = Slant: Deaminasi pepton aerobik  pH
Alk/Alk = alkali  ungu
Ungu/Ungu
Butt: Bakteri fermentasi glukosa
dalam suasana anaerob 
menghasilkan asam (kuning) 
aktivasi enzim dekarboksilase lisin
 terbentuk amin  pH alkali  ungu
Negati +/- = Slant: Deaminasi pepton aerobik  pH
f Alk/asam = alkali  ungu
Ungu/kunin Butt: Fermentasi glukosa  pH asam
g
Reaksi butt bisa tertutup kuning
 oleh warna H S yang hitam  hasil
2
dekarboksilasi (+) karena H2S hanya terbentuk pada suasana alkali.
MacFaddin JF. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. 3 rd Ed. Philadelphia: Lippincott Williams &
Wilkins; 2000.p.120-30.
 INTERPRETASI
2. Deaminasi Lisin (Aerobik)

Hasil Slant/Butt Keterangan H2S

Reaksi
Positif +/- = Red slant adalah Proteus memproduksi
Merah/Kuni karakteristik dari H2S, tapi tidak
ng Proteus dan menyebabkan medium
Providencia spp. berwarna hitam.

Slant: Deaminasi Butt:

lisin  warna oranye Glukosa terfermentasi 
Oranye + ungu asam  Proteus tidak
(dari deaminasi dekarboksilasi lisin  pH
pepton)  merah tetap asam  kuning.
bata
Asam menekan
produksi H2S  butt
tidak berwarna hitam.

MacFaddin JF. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. 3rd Ed. Philadelphia: Lippincott Williams &
Wilkins; 2000.p.120-30.
MIO
MOTILITY, INDOLE, ORNITHINE
MIO

MIO : Motility, Indole, Ornithine.

- Media satu tabung
- Membantu identifikasi Enterobacteriaceae
- Merupakan media semisolid (kadar agar 0.4 –
0.6 %)

MacFaddin JF. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. 3rd Ed. Philadelphia: Lippincott Williams &
Wilkins; 2000.p.459.
PRINSIP

• Menentukan motilitas bakteri

• Motil: umumnya batang karena memiliki flagella
• Bakteri motil memiliki varian nonmotile
• Sebagian kokus ada yang motil
• Membedakan genus dan spesies berdasarkan suhu
inkubasi (37oC dan 25oC)
TES MOTILITAS
TES MOTILITAS
Prinsip :
1. Untuk mengetahui apakah suatu organisme motil
atau tidak
2. Motilitas bakteri dengan flagel

• Flagel terutama terdapat pada basil (batang), namun

beberapa kokus juga motil.
• Bakteri yang motil bisa memiliki satu atau banyak
flagel dengan lokasi bervariasi
• Kadang pada bakteri motil terdapat varian nonmotil
yang terlihat stabil dan jarang menjadi bentuk motil

MacFaddin JF. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. 3rd Ed. Philadelphia: Lippincott Williams &
Wilkins; 2000.p.327-331
BAHAN DASAR TES MOTILITAS

F O R MU L A E D WA R D S D A N
EWING – PH 7.3 PH 7.2
• Beef extract 3g • Tryptose 10 g
• Pepton 10 g • NaCl 5g
• NaCl 5g • Agar 5g
• Agar 4g • Air distilasi 1000 mL
• Air distilasi 1000 mL
CARA PEMBUATAN

• Panaskan hingga larut

• Dispensing 5 mL per tabung
• Autoklaf 121oC, 15 psi, 15 menit
• Dinginkan pada posisi tegak, dinginkan 4-10oC
INOKULASI
1. Tumbuhkan dari kultur murni
2. Dengan ose jarum steril tusuk medium menyisakan
sekitar 6 mm dari dasar tabung.
3. Inkubasi pada 35OC.
4. Bila setelah 24 – 48 jam negatif  inkubasi pada 22
– 25OC selama 5 hari.

MacFaddin JF. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. 3rd Ed. Philadelphia: Lippincott Williams &
Wilkins; 2000.p.459.
 INKUBASI PADA 37 O C

UNTUK DIFERENSIASI GENUS UNTUK DIFERENSIASI SPESIES

Hasil Positif Hasil Negatif Hasil Positif Hasil Negatif
Enterobacter Klebsiella E. coli aerogenik E. coli
(biasanya +) anaerogenik
(inaktif)
Vibrio Actinobacillus (-)
Bacillus mycoides Bacillus anthracis
(biasanya +) Bacillus spp lain
Aeromonas spp Aeromonas (biasanya +)
lain salmonicida Bordetella avium B.parapertussis
Plesiomonas Aeromonas media B.bronchiseptica B. pertussis
shigelloides Legionella spp lain L. oakridgenus
Edwardsiella tarda Edwardsiella
Edwardsiella ictaluri
hoshinae

MacFaddin JF. Biochemical Tests for Identification of Medical

Enterobacter spp E.asburiae
Bacteria. 3rd Ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; lain (+) E.dissolvens
2000.p.459 E.hormaechei
 INKUBASI PADA 22 – 25 O C

UNTUK DIFERENSIASI GENUS UNTUK DIFERENSIASI SPESIES

Hasil Positif Hasil Negatif Hasil Positif Hasil Negatif
Listeria Corynebacterium Corynebacterium Corynebacterium
monocytogenes spp (biasanya -) aquaticum spp lain
C.Matruchotii (biasanya -)
Yersinia Yersinia spp lain
enterocolitica

MacFaddin JF. Biochemical Tests for Identification of Medical

Bacteria. 3rd Ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins;
INTERPRETASI HASIL
– Positif (motil):
• Terlihat gambaran kabut keruh yang berdifusi ke seluruh
media
• Kuman kontrol: E.coli, Clostridium sporogenes

– Negatif (non motil) :

• Pertumbuhan bakteri berupa garis yang terbatas pada garis
tusukan, media sekitarnya terang
• Kontrol: S.aureus

– Tabung kontrol :
• Tidak terdapat pertumbuhan, media tetap tidak berwarna dan
jernih

Mac Faddin. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. Philadelphia: Lippincott Williams &
Tes Motilitas Metode Hanging Drop (Alternatif)
TES INDOL
TES INDOL

• Untuk melihat kemampuan bakteri melepaskan indol dari triptofan  indol

dideteksi dengan reaksi kimia yang menghasilkan perubahan warna.
• Prinsip reaksi:

MacFaddin JF. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. 3rd Ed. Philadelphia: Lippincott Williams &
Wilkins; 2000.p.221-8.
MEDIA DASAR

B R O T H P E P T ON / T R I P T O FAN M E D I A C AS E I N
• Pepton komersial / pancreatic • Pancreatic digest of casein 2 g
digest of casein 10 g (casein mengandung 1.2 g
• NaCl 5 g triptofan per 100 g)
• Air deionisasi 1000 mL • NaCl 0.5 g

• Triptofan 1% • Air deionisasi 100 mL

 FUNGSI TES INDOL
UNTUK DIFERENSIASI

Hasil Positif Hasil Negatif

Escherichia coli Klebsiella (biasanya -)
Hafnia (-)
Enterbacter (biasanya -)
Serratia (biasanya -)
Pantoea agglomerans (-)
Haemophilus influenzae Haemophilus influenzae
I,II,V,VII III,IV,VI,VIII
Menggunakan Spot
Indole Test digabung
dengan Urease dan
Ornithine
Haemophilus Haemophilus parainfluenzae
parainfluenzae IV, VI,VII, I,II,III
VIII
Haemophilus Semua Haemophilus spp lain
paracuniculus indol –

MacFaddin JF. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. 3rd Ed. Philadelphia: Lippincott Williams &
Wilkins; 2000.p.221-8.
 TES INDOL KOVACS
Reagen (simpan dalam botol inaktinis) :
- Amil atau isoamil alkohol murni 150 mL  lebih stabil
dibandingkan Ehrlich
- P-Dimetilaminobenzaldehid (DMAB) 10 g
- HCl (concentrated) 50 mL
- Larutkan DMAB ke dalam alkohol, kadang butuh pemanasan (50 – 60 C
di waterbath)
- Perlahan, tambahkan asam ke campuran aldehid-alkohol.
Tambahkan 5 tetes reagen Kovacs ke dalam tube yang sudah
diinkubasi bakteri 24 – 48 jam  goyang perlahan.
Hasil positif akan menunjukkan warna merah.

MacFaddin JF. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. 3rd Ed. Philadelphia: Lippincott Williams &
Wilkins; 2000.p.221-8.
TES INDOL EHRLICH

• Lebih sensitive untuk mendeteksi batang nonfermenter atau anaerob dengan

produksi indol minimal
• DMAB 1g
• Absolut alcohol 95 mL
• HCl konsentrat 20 mL

• Tambahkan persis 1 mL ether atau xylene ke tabung broth yang sudah

diinkubasi bakteri untuk ekstraksi dan konsentrasi indol, kocok rata, tunggu
sampai ether ke permukaan, tambahkan 0.5 mL Ehrlich di dinding tabung miring
REAKSI:

Koneman’s. The Enterobacteriacea In : Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiolgy , 6th Ed. Phliadelphia : Elsevier ; 2006: p.221
INTERPRETASI

• Positif (detik)  warna bright fuchsia di antara media dengan fase alcohol
--- E.coli
• Negatif: tidak ada warna di fase alcohol, warna agak kuning dari reagen
Kovacs/Ehrlich, agak keruh --- Enterobacter cloacae, P.aeruginosa
• Variabel: warna oranye di permukaan media karena adanya
skatol(precursor indol)
TES ORNITIN
DEKARBOKSILASI ORNITIN

L-Ornitin akan didekarboksilasi menjadi putrescine (di-amin) dan karbon

dioksida.

MacFaddin JF. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. 3rd Ed. Philadelphia: Lippincott Williams &
Wilkins; 2000.p.120-30.
 MANFAAT
U N TU K D IF E R E N S I A S I U N T U K D IF E R E N S I A S I
GENERA S P E S IE S

Hasil Positif Hasil Negatif Hasil Positif Hasil Negatif

Enterobacter Klebsiella Salmonella spp lain Salmonella typhi
(biasanya +) Salmonella
Morganella Providencia spp (-) cholerasuis
morganii biogrup 1 serovar gallinarum
dan 2 (-, 24 h)
Shigella sonnei Shigella spp lain
Proteus mirabilis Proteus spp lain
Aeromonas veronii Aeromonas spp
lain

MacFaddin JF. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. 3 rd Ed. Philadelphia: Lippincott
Williams & Wilkins; 2000.p.120-30
TES ORNITIN PADA MIO
Fermentasi
glukosa pada
kondisi anaerobik
pH bergeser 
indikator warna
Asam piruvat berubah menjadi
 suasana kuning
asam

Apabila kuman mampu melakukan

dekarboksilasi ornitin

Aktifkan ornitin
dekarboksilase L–ornitin

pH bergeser  indikator
Diamine putresin + CO2 
warna berubah menjadi
suasana alkali ungu
E. COLI CITROBACTER E. CLOACAE K. PNEUMONIAE

+ Tes:
+ – Indol
– –
+ + – Motility
+ +
+ – Ornithin
e
 ou
k -Y
a n
Th