Kultur jaringan hewan

Untuk mempelajari sel hewan yang bebas pengaruh sistem

kehidupan hewan (stres, homeostasis)
Kultur sel /organ dibiakkan dalam bejana(in vitro) yang
medianya/lingkungannya menyerupai in vivo (hewan)
 beda kultur tanaman dan hewan
• pada tanaman : sel yang dikultur jumlah
selnya bertambah banyak hingga menjadi
tanaman baru. Pada sel hewan berbeda. Sel
hewan yang dikulturkan, tidak menjadi hewan
baru, melainkan jumlah sel yang bertambah
dan kehidupan sel dapat dipertahankan walau
sudah terpisah dari tubuh hewan.
 aplikasi

• Uji obat (antiviral)

• Uji toksisitas suatu zat
• Produksi dan uji vaksin
• Propagasi virus
 Lingkungan untuk kultur jaringan

• Steril:
• ruang: laminar air flow hood (dilengkapi uv)
• Alat: pipet, filter (0,45µl), flask, mikroplate yang bagian dasarnya
flat (24, 96 well)
• Media: sintetik dari bahan kimia: MEM: minimun essensial media:
(asam amino arginin, sistein, isoleucine, leucine, lysine,
methionine, phenilalanin, tryptophan, tyrosin, valin), vitamin (
B,A,C), air (aquabidest), antibiotika, antifungi.
• Medium RPMI (roswell Park Memorial Institute): untuk sel darah
• BSS (balance salt solution) hanks: untuk biak sel tanpa CO2
• Media pemelihara (maintenance medium): + serum(FBS: fetal
bovine serum) 2-5%
• Media penumbuh( growth medium): + serum 10%.
 Macam sel

• Sel primer:sel yang dikultur pertama kali

langsung dari hewan (embrional). Setelah
disubkultur 1x: biak sel sekunder, 2x: tersier
dst. Kemampuan dipasase terbatas.
• Contoh sel fibroblas embrio ayam, sel ginjal
hamster.
• Sel line: sel turunan: biak sel dapat dibiakkan
terus, kemampuan tumbuh tak terbatas.
• Sel line dapat diperoleh dari perusahaan
pembuat : ATCC (American Type culture
collection).
• Contoh: sel Vero(ginjal kera african green),
BHK-21 (ginjal anak hamster, Hela (carcinoma
cervix manusia).
• Sel MDBK (Madin Darby bovine kidney)
• pengawetan sel: +dimethylsulfoxide (DMSO)
5-15%, dlm tangki nitrogen cair -1960C
 Faktor lain
• pH: 7,2-7,4 (bufer dan indikator:phenol red:
asam: kuning, basa: merah)
• CO2: 5%, untuk mempertahankan pH
• Tekanan osmose (7,6 atm): Na Cl
• Ion Na, K, Mg, Cl, PO4, CO3: penting untuk
mempertahankan tekanan osmose
• Ca, Mg++ untuk menjaga perlekatan sel.
 kultur sel line
• dari tempat penyimpanan (liquid nitrogen)
dithawing suhu 370C, segera disentrifuse 1500
rpm, 10 menit.
• Segera encerkan dan dibuat suspensi dengan
medium penumbuh.
• tanam di flask.
 Tahap Pembuatan kultur sel primer

• Persiapan hewan yang dipakai (hewan muda/ embrio yang

sehat: mudah dibiakkan dp yang dewasa)
• Pengambilan jaringan (cegah kerusakan jaringan: masukkan
dalam bufer dingin)
• Proses pemisahan sel (dipotong kecil-kecil, digunakan enzime:
tripsin untuk dispersi sel)
• Penghilangan sisa-sisa jaringan (difilter dengan kain kassa
steril)
• Penghitungan sel (dengan hemocytometer)
• Pembuatan suspensi sel (sel primer 2 juta sel/ml, sel line
300.000 sel/ml)
• Penanaman sel dan inkubasi : 370C. CO2 5%
 penghitungan sel
• dengan hemositometer
• suspensi sel + triphan blue 0,4%, 1:1, biarkan
5 menit, kmd diisikan ke hemositometer
• hitung 4 kotak. Sel hidup: tidak menyerap
warna biru, sel mati: biru
• jumlah sel terhit x faktor konversi alatx faktor
4 (10.000) pengenc.
•
 pengamatan

• Tiap hari diamati dengan mikroskop inverted.

• Konfluent/ belum
• Kontaminasi bakteri/ jamur: media keruh
• Warna media: pH Netral : merah.
• berubah warna kuning: menjadi asam:segera
ganti media .
 Contoh:

sel MDBK yang konfluen

 Aplikasi
• Penelitian: Melihat efek virus pada sel
• Contoh: virus herpes sapi/bovine herpes virus:
grape like cluster
Sincytium akibat virus
Newcastle Disease
 aplikasi
• Plaque assay: menghitung jumlah virus (pfu: plaque forming
unit)
• Kultur sel
• Infeksi virus (berbagai enceran): 10-1 10-2 10-3 10-4
• Adsorbsi virus
• Agar overlay 1 : agar purified 1% (water bath 45 0C) +Media
pemelihara 2x kepekaan (Agar+media 1:1)
• Agar overlay 2= agar overlay I+ neutral red 0,001%.
(Agar+media 1:1)
• plaque
 Immunoperoxidase monolayer assay (IPMA)

• Diagnosa virus
• Kultur sel
• Infeksi virus
• Fiksasi (aseton 35%)
• Antibodi monoklonal primer
• Antibodi sekunder –biotinylated
• Streptavidin-peroxidase
• Substrat-chromogen
• Warna coklat pada sel terinfeksi
 Immunoperoxidase monolayer assay

sel MDBK yang tidak

diinfeksi virus bovine
herpes: warna
transparan pada sel

sel MDBK yang diinfeksi

virus bovine herpes:
warna kecoklatan pada
sel
 Uji toksisitas
Kultur sel

Ekstrak berbagai enceran 100%, 80%, 50%.....10%, …. 0%

Treatmen sel dengan ekstrak

Lihat efek pada sel (kerusakan sel)