Puji Kurniawati, M.

Sc

PEWARNAAN MIKROBA
PENDAHULUAN
 Mikroba dapat dilihat dengan
mikroskop, tapi bagian-bagian sel tidak
mudah diamati
 Sitoplasma sel memiliki indeks bias
yang hampir sama dengan indeks bias
lingkungannya yang bersifat cair 
tidak mengadsorpsi dan membiaskan
cahaya
 Pewarnaan  kontras antara sel dan
latar belakang dapat diperjelas
PENDAHULUAN
 Zat warna  menyerap dan membiaskan
cahaya  kontras dapat ditingkatkan
 Pengamatan: struktur spora, flagella, bahan
inklusi (pati dan granula fosfat)
 Fungsi:
 Menunjukkan distribusi dan susunan kimia sel
 Membedakan mkroba satu dengan lainnya
 Menentukan pH
 Potensial oksidasi reduksi ekstraseluler dan
intraseluler
TUJUAN PEWARNAAN
• Memudahkan melihat mikroba dengan
mikroskop

• Memperjelas ukuran dan bentuk mikroba

• Melihat struktur luar dan struktur dalam

mikroba (vakuola dan dinding sel)

• Menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia khas

dari mikroba
ZAT WARNA
 Definisi: persenyawaan organik yang memiliki
gugus kromofor dan auxokrom yang terikat
dalam cincin benzena
 Kromofor  memberikan warna pada molekul cat
 Gugus azo (- N=N -), nitroso (- N=o), tio (=C=S), nitro
(- NO3)
 Auxokrom  memberikan disosiasi elektrolir
pada molekul cat sehingga cat bersifat mudah
bereaksi
 Gugus –NR2, -NH2, -OH, -OCH3, -I, -Br, -Cl
ZAT WARNA
 Biasanya garam organik
 Reaksi mikroba dengan ion garam akan
menghasilkan warna yang berbeda
 Sel bermuatan negatif pada lingkungan
netral  bereaksi dengan ion positif zat
warna
 Zat warna
 Zat warna asam
 Zat warna basa
ZAT WARNA BASA
 Bermuatan positif
 Mewarnai bagian sel yang negatif
(membran sel, dinding sel, sitoplasma)
 Muatan positif akan terikat pada bagian
sel yang bermuatan negatif sehingga
membentuk warna
 Pewarnaan positif  sel memiliki warna
ZAT WARNA ASAM
 Bermuatan negatif
 Fungsi: mewarnai latar belakang
sediaan
 Zat warna negatif digunakan untuk
mewarnai bagian sel yang positif
 Muatan dan daya ikat zat warna
tergantung pada pH sekitarnya
sewaktu pewarnaan
 Pewarnaan negatif  latar belakang
memiliki warna
JENIS PEWARNAAN

Pewarnaan Khusus
• Digunakan untuk melihat salah satu
struktur sel
Pewarnaan Diferensial
• Digunakan untuk memilahkan
mikroorganisme
• Pewarnaan Gram, pewarnaan Ziehl-
Neelsen
MEKANISME PEWARNAAN

Berdasarkan mekanisme pengikatan

kimia
• Ehrlich, Mayer, Heiden-Hein, Giemsa
• Jaringan sel terdiri atas gugus bersifat asam dan
basa, yang akan bereaksi dengan gugus asam atau
basa zat warna
Berdasarkan mekanisme
• Struktur sel merupakan proteinpengikatan
atau asam amino 
amfoter
fisika
• Fischer, Appleyard, Freundlich
• Peristiwa pengikatan warna merupakan proses
adsorpsi warna pada konstituen sel
FAKTOR-FAKTOR YANG MEMPENGARUHI

Intensifikas
Peluntur
Fiksasi i
zat warna
pewarnaan

Counterstr
Substrat
ain
FIKSASI
 Fungsi:
 Merekatkan sel mikroba pada gelas obyek
 Membunuh mikroba secara cepat tanpa menyebabkan
perubahan bentuk dan strukturnya
 Mengubah afinitas (daya ikat) zat warna
 Membuat sel mikroba lebih keras
 Melepaskan granuler (butiran) protein menjadi gugus
aktif (-NH3+) yang akan bereaksi dengan gugus aktif zat
warna (-OH)
 Mencegah otolisis sel (pecahnya sel akibat enzim)
 Mempertinggi reaktivitas gugus tertentu(karboksil,
amina primer, sulfohidril)
FIKSASI
 Cara fisik (pemanasan atau freeze drying)
atau penambahan agensia kimia (sabun,
fenol, formalin)
 Pemanasan  membuat suspensi di atas
preparat kemudian diangin-anginkan atau
dipanaskan di atas lampu spiritus
 Agensia fiksasi kimia:
 Asam cuka dan asam pikrat
 Alkohol dan aseton
 Asam kromat dan asam osmiat
PELUNTUR ZAT WARNA (DECOLORIZER)
 Suatu senyawa yang menghilangkan warna
dari sel yang telah diwarnai
 Variasi kecepatan pelunturan zat warna
digunakan untuk membedakan bermacam-
macam jenis bakteri pada pewarnaan
diferensial
 Tahan asam  zat warna terikat kuat oleh sel
sehingga tidak dapat dilunturkan oleh asam
 Tahan alkohol, tahan air
MACAM PELUNTUR ZAT WARNA

Logam Logam
Asam Basa Lemah
berat ringan
• HNO3 • KOH • Alkohol • AgNO3 • Na2SO4
• HCl • NaOH • Air • CuSO4 • MgSO4
• H2SO4 • Sabun • Minyak
• Campura • Garam cengkeh
n asam basa • Aseton
tersebut • Gliserin
dengan
alkohol
INTENSIFIKASI PEWARNAAN
 Cara:
 Mempertinggi kadar zat warna
 Mempertinggi temperatur pewarnaan (60 –
90oC)
 Menambahkan mordan
 Mordan  suatu zat kimia yang dapat
menyebabkan sel mikroba dapat
diwarnai lebih intensif atau zat warna
dapat terikat lebih kuat pada jaringan
sel
MORDAN

Basa Asam

• Mordan yang • Mordan yang

bereaksi dengan bereaksi dengan
anion zat warna zat-zat warna
asam basa
• FeSO4, kalium • Asam tanin,
antinomium asam pikrat
tartrat, asetil
piridinium klorida
SUBSTRAT
 Berdasarkan zat warna yang diserap:
 Sel basofil  sel yang dapat mengikat zat
warna basa
 Sel asidofil/oksifil  sel yang dapat
mengikat zat warna asam
 Sel sudanofil  sel yang dapat mengikat
zat warna yang dapat larut dalam minyak
COUNTERSTAIN (ZAT WARNA PENUTUP/ZAT WARNA LAWAN)

 Definisi : suatu zat warna basa yang

berbeda warnanya dengan zat warna
mula-mula yang digunakan
 Fungsi: memberikan warna pada sel yang
berbeda warnanya dengan zat warna
mula-mula
 Tujuan: memberikan kontras pada sel
yang menyerap zat warna utama
 Contoh: MB, safranin, erytrosin
PERSIAPAN PEWARNAAN MIKROBA: PEMBUATAN PREPARAT
MIKROBA

 Syarat:
 Tidak terlalu tebal/tipis
 Fiksasi dengan panas  tahan pencucian
satu kali atau lebih
 Bentuk sel tidak berubah atau terjadi
penyusutan
 Kaca obyek tidak boleh tergores/ bersih
PERSIAPAN PEWARNAAN MIKROBA: PEMBUATAN PREPARAT
MIKROBA

 Olesan tebal  sel bakteri akan

menumpuk  sulit menentukan bentuk
sel individu
 Olesan tebal  jumlah cahaya yang
lewat spesimen berkurang
 Olesan tipis  menyulitkan
pengamatan mikroskopis
CARA
PENYIAPAN
OLESAN