Blgo.

César Alexander Ortiz Rojas

Facultad de Medicina Humana
“Hipolito Unanue” - UNFV
ESTUDIOS 1980
GENÉTICOS FISH

Citogenética
1960

1990
PCR

Real time PCR

2000

2005 Secuenciación
 Estudio Genético

IMPORTANCIA Pruebas básicas

• Diagnóstico • Cariotipo (Citogenética
Convencional)
• Pronóstico: Evolución • FISH (Citogenética
de la enfermedad Molecular)
• Predictivo: Respuesta • PCR (Análisis Molecular)
al tratamiento • Secuenciación
• Monitorización
terapéutica
Qué estudiamos ?

Muestra biológica

DNA RNA
CARIOTIPO
PCR
(Reacción en Cadena de la Polimerasa)
SECUENCIAMIENTO
CITOGENÉTICA CONVENCIONAL
CLASIFICACIÓN DE LOS CROMOSOMAS de acuerdo a la
posición del centrómero según Levan et al., 1964
TECNICAS EN CITOGENETICA CONVENCIONAL: Se basa en el uso
de tinciones (Bandeo) para analizar número y estructura de los
cromosomas.

Bandeo
Banda G: Regiones ricas en A y T

Banda R: Inversa de las G

Banda C: Regiones centroméricas

Banda T: Regiones teloméricas

Bandeo G (de rutina)

TIPOS DE BANDEO
 Cromosomas Cromosomas Bandas
sexuales afectados implicadas

Número de
cromosomas Número de
cromosomas
¿Cómo se hace un cariotipo ?
Coloración y
tratamiento
enzimático
(tripsina)
Estación de
Citogenética
Cromosomas en metafase
Cariotipo
CITOGENÉTICA MOLECULAR

SKY (Spectral Karyotyping)

 FISH: Concepto
• La FISH es una técnica de mapeo físico de DNA en la que una sonda de
DNA, etiquetada con una molécula marcadora, hibrida con los
cromosomas en una lámina portaobjetos y se visualiza en el microscopio
de fluorescencia con luz UV

Adenina  Timina
Guanina  Citosina
Técnica de FISH
 SONDAS PARA FISH
Locus
Centroméricas específicas Painting

Cr. 21 Cr. 9 Cr. 5

t(9;22)

Cr. 22
 Aplicaciones del FISH en cáncer

HER-2/neu: Su positividad tiene valor pronóstico, dado que se asocia con

enfermedad más agresiva, y valor predictivo porque permite la identificación
de pacientes que pueden beneficiarse de trastuzumab (comercializado con la
marca Herceptin® por Roche).

Her2 RESULTADO:
NEGATIVO PARA AMPLIFICACIÓN
GÉNICA DE HER-2/neu

Proporción
HER2/neu CEN-17
HER2/CEN-17
cen17
Puntuación
Total
54 30 1,8
Tumors with a HER-2:CEP17 signal ratio of <2 were considered
to be nonamplified, whereas those with a ratio of 2 or greater
were considered to have “low amplification” (2.0–3.0),
“moderate amplification” (3.1–5.0), or “high amplification” (>5).

Her2
cen17 RESULTADO:
NEGATIVO PARA AMPLIFICACIÓN GÉNICA DE HER-2/neu

Proporción
HER-2/neu CEP-17
HER-2/CEP-17
Puntuación
Total
35 25 1,4
 cen17 RESULTADO:
POSITIVO PARA AMPLIFICACIÓN GÉNICA DE
Her2
HER-2/neu
Proporción
HER2/neu CEN-17
HER2/CEN-17
Puntuación
Total
109 34 3,21

Her2 RESULTADO:
POSITIVO PARA AMPLIFICACIÓN GÉNICA DE
HER-2/neu

Proporción
HER-2/neu CEP-17
cen17 HER-2/CEP-17

Puntuación
Total
150 33 4,54
 Her2

cen17

RESULTADO: Proporción
HER-2/neu CEP-17
POSITIVO PARA AMPLIFICACIÓN GÉNICA DE HER-2/CEP-17
HER-2/neu Puntuación
Total
156 29 5.38
Diagnóstico molecular
Determinar cambios en la secuencia o en la expresión de genes,
mediante técnicas de biología molecular.

Diagnóstico
Sensibilidad
Pronóstico

Terapia blanco
Especificidad
Monitoreo
APLICACIÓN DE BIOLOGIA MOLECULAR
EN CÁNCER
 Estudios genéticos
en cáncer

DIAGNÓSTICO PRONÓSTICO PREDICTIVO MONITOREO

0 Historia natural del cáncer

 Leucemia Mieloide Crónica
Del cromosoma Ph al gen de
fusión BCR-ABL

22q-
LMC
95%

LLA ̴ 5% niños
t(9;22)(q34;q11)
40% adultos
Análisis
Citogenético

Cromosoma
Philadelphia

46,XX,t(9;22)(q34;q11)
 q34

Chr.9

e1b e1a e2 e3 e4 e5 e6 e7 e8 e9 e10 e11 ABL

12 exones: 230 kb - mRNA de 6 y 7 kb – proteína 145 kDa

q11

Chr.22

e1 e2 e3 e21 e22 e23 BCR

23 exones: 130 kb - varios mRNA de 4.5 kb y 7 kb – proteína 130, 160, 190 KDa
 5´ 3´
BCR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

5´ 3´ NORMAL
ABL 1b 1a 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

ISOFORMAS DE LA FUSIONES GÉNICAS EN BCR-ABL

MAJOR (Mbcr) p210 LMC

12 2

MINOR (mbcr) p190 LLA

1 2

BCR-ABL
PROTEINA TIROSINA KINASA

INHIBIDORES TK
 PCR
Reacción en Cadena de la Polimerasa
Es la amplificación (hacer múltiples copias) de un fragmento
específico de DNA in vitro por medio de la polimerización de
sus cadenas utilizando un termociclador, utilizando cantidades
mínimas de material genético
Denaturación Alineamiento Extensión
 REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA - PCR
PCR es básicamente una técnica de amplificación del DNA.

DNA
PCR
Muchas
moleculas
(molecule sencilla) amplificación
 ELEMENTOS QUE SE REQUIEREN EN
LA SINTESIS DEL DNA POR PCR

Tampón o Buffer
 Enzima DNA polimerasa: sólo puede iniciar la síntesis
de una cadena de DNA a partir de un 3’OH libre.
 Cebadores o primers: secuencia corta de
nucleótidos complementaria a la hebra templado.
 Ión magnesio (Mg++): Cofactor de la polimerasa
 dNTPs : desoxirribonucleósidos trifosfatados
 Hebra Templado (DNA o cDNA)
 PCR
Temperatura
100
Denaturación
94 oC

50

0
Tiempo

3’ 5’
DNA de cadena 5’ 3’
doble
 PCR
Temperatura
100
Denaturación
94 oC

50

0
Tiempo
3’ 5’

DNA de
cadena simple
Calor

5’ 3’
 PCR
Temperatura
100
Denaturación Denaturación
94 oC Extension 94 oC
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
Tiempo
3’ 5’
5’

Hibridación
de primers

5’
5’ 3’
 PCR
Denaturación30 ciclos

Temperatura
100
Denaturación
94 oC Extension 94 oC
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
Tiempo
3’ 5’

Calor
5’

5’

Calor
5’
5’ 3’
 PCR
Denaturación30ciclos

Temperatura
100
Denaturación
94 oC Extension 94 oC
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
Tiempo
3’ 5’
5’

5’
5’

5’
5’

5’
5’ 3’
 PCR
Denaturación30ciclos

Temperatura
100
Denaturación
94 oC Extension 94 oC
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
3’
5’
5’ Tiempo
5’
5’
5’ 3’

Calor
5’

5’

Calor
5’
 PCR Denaturación30ciclos

Temperatura
100
Denaturación
94 oC Extension 94 oC
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
3’
5’
5’ Tiempo
5’
5’ 5’
5’ 3’

5’
5’

5’
5’

5’
5’
 PCR
Denaturación30ciclos

Temperatura
100
Denaturación
94 oC Extension 94 oC
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
3’
5’
5’ Tiempo
5’
5’ 5’
5’ 3’

5’
Fragmentos de 5’

tamaño definido
5’
5’

5’
5’
El numero de copias del DNA delimitado por los primers se
duplica en cada ciclo de PCR.

Numero de copias
1 2 4 8 16 32 64

0 1 2 3 4 5 6
# ciclos
 RT-PCR
mRNA AAAAAAAAAA-3’ Primer Antisense:
(sense) TTTTTTTTTT-5’ oligo(dT)o

Transcripción reversa

AAAAAAAAAA-3’
TTTTTTTTTT-5’
1ra cadena cDNA

PCR usando
primers
F
Molde de cDNA
R
VISUALIZACION DE LOS PRODUCTOS DE PCR

ELECTROFORESIS HORIZONTAL
ELECTROFORESIS HORIZONTAL
Ejemplo de diagnóstico en Leucemia
promielocítica aguda – PML/RARa
 p210 p190

Citogenética, PCR

Citogenética

PCR
PCR Tiempo Real
PCR TIEMO REAL: CUANTIFICACIÓN

P1

P2 P3

P4

P1
P2 POSITIVOS
P3
P4 NEGATIVO
 MUTACIONES
PUNTUALES EN
BCR-ABL
(Secuenciamiento)
 se produce por acumulación de
Cáncer Colorectal mutaciones
Criptas Foco
epiteliales de cripta
intestinales aberrante Adenoma Carcinoma

APC KRAS , otros BRAF SMAD2 TP53

SMAD4 LOH 17p
LOH 18q
CIN (Inestabilidad cromosómica)
MSI (Inestabilidad de microsatélites)
CIMP (Fenotipo metilador CpG)
HMG (Hipometilación en DNA global)
INESTABILIDAD CROMOSÓMICA
(CIN)

Presente en 70% de los

tumores de colon.

Mal pronóstico

Clínicamente no informativo

NO test genético consenso

 INESTABILIDAD DE MICROSATÉLITES
(MSI)

Microsatélites son secuencias repetitivas

de DNA.

Se estudian por PCR:

BAT25, BAT26, DS123, D5S346, D17S250

Se analiza comparando patrones:

DNA TUMORAL vs DNA NORMAL

Sospecha de mutaciones en genes

reparadores

Se detectan en 15% de los casos de

cáncer de colon esporádico y 95% HNPCC

Tienen valor diagnóstico (S. Lynch):

mutación germinal
 SOSPECHA CLÍNICA
DE S. DE
LYNCH/HNPCC

MIS
Ca
IHC: MLH1, MSH2, MSH6, PMS2

+ - BRAF V600E
Hipermetilación de MLH1
BRAF normal
esporádico

SECUENCIAMIENTO
MLH1, MSH2, MSH6,
PMS2

Mutación en algún MMR:

S. Lynch
Diseño del estudio
AGTGCATCGATCGATGCTAGCTGACTGATCGATCGATGATCGATCGAGGGAG
AGAGGCGCGCGCGCTAGCTGACTAGTATATTAATATTCGCGATGCATCGTAG
CTAGCTCGATCGATGCTAGCTGATCGATCGTAGCTAGCGGGGGGCAGGCGC
GCGCCCCCCAGCGTCGATGCTTTTATATATTAGCGTAGCTACGTAGCTAGCTA
GTGCATCGATCGATGCTAGCTGACTGATCGATCGATGATCGATCGAGGGAGA
GAGGCGCGCGCGCTAGCTGACTAGTATATTAATATTCGCGATGCATCGTAGC
TAGCTCGATCGATGCTAGCTGATCGATCGTAGCTAGCGGGGGGCAGGCGCG
CGCCCCCCAGCGTCGATGCTTTTATATATTAGCGTAGCTACGTAGCTAGCTAG
TGCATCGATCGATGCTAGCTGACTGATCGATCGATGATCGATCGAGGGAGAG
Material AGGCGCGCGCGCTAGCTGACTAGTATATTAATATTCGCGATGCATCGTAGCTA
genético GCTCGATCGATGCTAGCTGATCGATCGTAGCTAGCGGGGGGCAGGCGCGC
GCCCCCCAGCGTCGATGCTTTTATATATTAGCGTAGCTACGTAGCTAGCTAGT
GCATCGATCGATGCTAGCTGACTGATCGATCGATGATCGATCGAGGGAGAG
AGGCGCGCGCGCTAGCTGACTAGTATATTAATATTCGCGATGCATCGTAGCTA
GCTCGATCGATGCTAGCTGATCGATCGTAGCTAGCGGGGGGCAGGCGCGC
GCCCCCCAGCGTCGATGCTTTTATATATTAGCGTAGCTACGTAGCTAGCTAGT
ANÁLISIS DE SECUENCIAS GCATCGATCGATGCTAGCTGAAGTGCATCGATCGATGCTAGCTGACTGATCG
ATCGATGATCCGATGCTAGCTGACTGATCGATCGATGATCGATCGAGGGAGA
GAGGCGCGCGCGCTAGCTGACTAGTATATTAATATTCGCGATGCATCGTAGC
Normal AGTATATTAATATTCG TAGCTCGATCGATGCTAGCTGATCGATCGTAGCTAGCGGGGGGCAGGCGCG
CGCCCCCCAGCGTCGATGCTTTTATATATTAGCGTAGCTACGTAGCTAGCTAG
P2
P1 AGTATATTAGTATTCG
AGTATATTAATATTCG TGCATCGATCGATGCTAGCTGACTGATCGATCGATGCGATGCTAGCTGACTG
Mutación
100% coincidencia ATCGATCGATGATCGATCGAGGGAGAGAGGCGCGCGCGCTAGCTGACTAGT
ATATTAATATTCGCGATGCATCGTAGCTAGCTCGATCGATGCTAGCTGATCGAT
CGTAGCTAGCGGGGGGCAGGCGCGCGCCCCCCAGCGTCGATGCTTTTATAT
ATTAGCGTAGCTACGTAGCTAGCTAGTGCATCGATCGATGCTAGCTGACTGAT
CGATCGATGCGATGCTAGCTGACTGATCGATCGATGATCGATCGAGGGAGA
GAGGCGCGCGCGCTAGCTGACTAGTATATTAATATTCGCGATGCATCGTAGC
PCR PCR
EN TIEMPO SECUENCIAMIENTO EN
REAL
TUMORES SÓLIDOS
GTGGCCGGCATGTCGGGGGCGGGGGGCGCCTTTGCCTCGCCGAGGGAGGTCTTGCTGGAGCGGCCGTGCTGGCTGGACGGGGGCTGCGAGCCGGCCCGCAGGGGCTACCTCTACCAGCAGCTG
TGCTGCGTAGATGAGCGGGATCGTGTGCAGAAGAAAACCTTCACCAAGTGGGTCAACAAGCACCTCATCAAGGCCCAGAGGCACATCAGTGACCTGTATGAAGACCTCCGCGATGGCCACAACCT
CATCTCCCTGCTGGAGGTCCTCTCGGGGGACAGCCTGCCCCGGGAGAAGGGGAGGATGCGTTTCCACAAGCTGCAGAATGTCCAGATTGCCCTGGACTACCTCCGGCACCGCCAGGTGAAGCTGG
TGAACATCAGGAATGATGACATCGCTGACGGCAACCCCAAGCTGACCCTTGGCCTCATCTGGACAATCATTCTGCACTTCCAGATCTCAGATATCCAGGTGAGTGGGCAGTCGGAGGACATGACGG
CCAAGGAGAAGCTGCTGCTGTGGTCGCAGCGAATGGTGGAGGGGTACCAGGGCCTGCGATGCGACAACTTCACCTCCAGCTGGAGAGACGGCCGCCTCTTCAATGCCATCATCCACCGGCACAA
GCCCCTGCTCATCGACATGAACAAGGTGTACCGGCAGACCAACCTGGAGAACCTGGACCAGGCCTTCTCTGTGGCGGAGCGGGACCTGGGAGTGACGCGGCTCCTGGACCCTGAGGACGTGGAT
GTCCCTCAGCCCGACGAGAAGTCCATCATCACCTACGTCTCGTCGCTGTATGACGCCATGCCCCGCGTGCCGGACGTGCAGGATGGGGTGAGGGCCAACGAGCTGCAGCTGCGCTGGCAGGAGT
ACCGGGAGCTGGTGCTGCTGCTGCTTCAGTGGATGCGACACCACACGGCCGCCTTTGAGGAACGCAGGTTCCCCTCCAGCTTCGAGGAGATTGAGATCCTGTGGTCTCAGTTCCTGAAGTTTAAG
GAGATGGAGCTACCAGCCAAGGAGGCCGACAAGAACAGGTCCAAGGGCATCTACCAATCCCTGGAGGGAGCGGTGCAAGCAGGCCAGCTCAAGGTGCCCCCTGGCTACCACCCGCTGGATGT
GGAGAAGGAGTGGGGCAAGCTGCACGTGGCCATCCTGGAGCGGGAGAAGCAGCTCCGCAGCGAGTTTGAGAGGCTGGAGTGTCTTCAGCGCATCGTGACCAAGCTGCAGATGGAGGCGGG
GCTGTGTGAGGAGCAGCTGAACCAGGCCGACGCCCTGCTGCAGTCGGATGTCCGGCTGCTGGCTGCAGGCAAAGTGCCACAGCGGGCGGGGGAGGTGGAACGGGACTTGGACAAGGCGGATA
GCATGATCCGGCTGCTCTTCAACGACGTGCAGACCCTCAAGGATGGACGGCACCCGCAGGGCGAGCAGATGTACCGCAGGGTGTACCGTCTGCACGAGCGCCTGGTAGCCATCCGCACCGAGTA
CAACCTACGGCTGAAGGCAGGCGTGGCGGCCCCTGCAACCCAGGTGGCCCAGGTGACTCTGCAGAGTGTGCAGAGGCGCCCCGAGCTGGAGGACTCCACTCTGCGCTACCTGCAGGACCTGCTG
GCCTGGGTGGAGGAGAACCAGCACCGTGTGGATGGCGCTGAGTGGGGTGTGGACCTGCCCAGCGTGGAGGCGCAGCTGGGCAGCCACCGAGGCCTGCACCAGTCCATCGAAGAATTCCGGGCC
AAGATCGAGCGGGCACGGAGTGACGAGGGCCAGCTCTCCCCCGCCACCCGGGGTGCCTACCGTGACTGCCTGGGTCGGCTGGACCTGCAGTACGCCAAGCTGCTGAACTCCTCCAAGGCCCGCC
TCAGGTCCCTGGAGAGCTTGCACAGCTTTGTGGCAGCCGCCACTAAGGAGCTAATGTGGCTGAATGAGAAGGAGGAGGAGGAGGTGGGCTTCGACTGGAGCGACCGCAACACCAACATGACCG
CCAAGAAGGAGAGCTACTCGGCGCTGATGCGGGAGCTGGAGCTGAAGGAGAAGAAGATCAAGGAGCTCCAAAATGCTGGGGACCGGCTGCTGCGGGAGGACCACCCGGCCCGGCCCACGGTG
GAGTCCTTCCAGGCGGCCCTGCAGACGCAGTGGAGCTGGATGCTACAGCTGTGCTGCTGTATCGAGGCACACCTGAAGGAGAACGCTGCCTACTTTCAGTTCTTCTCAGATGTGCGGGAGGCCGA
GGGGCAGTTGCAGAAGCTGCAGGAGGCACTGCGTAGGAAATACAGTTGTGATCGCTCCGCCACCGTCACCCGGCTGGAGGACCTGCTGCAGGATGCCCAGGACGAGAAGGAACAGCTGAACGA
BRCA1
GTACAAGGGCCACCTCTCAGGCCTGGCCAAGCGGGCCAAGGCCGTCGTGCAGCTGAAGCCCCGCCACCCAGCCCACCCCATGCGGGGCCGCCTGCCCCTGCTGGCCGTGTGCGACTATAAGCAG
GTGGAGGTGACTGTGCACAAGGGTGACGAGTGCCAGCTGGTGGGCCCTGCACAGCCGTCCCACTGGAAGGTGCTCAGCAGCTCCGGCAGCGAGGCCGCCGTGCCCTCCGTGTGCTTCCTGGTGC
CCCCGCCCAACCAGGAGGCCCAGGAGGCCGTCACCAGGCTGGAGGCCCAGCACCAGGCCCTGGTCACGCTGTGGCACCAGTTGCACGTGGACATGAAGAGCCTTCTGGCCTGGCAGAGCCTTCG
APC
CCGCGACGTGCAGCTCATCCGCTCCTGGTCCCTGGCCACGTTCCGCACCCTGAAGCCAGAGGAGCAGCGCCAAGCCCTGCACAGCCTGGAGCTGCACTACCAGGCCTTCCTGCGGGACAGCCAGG
ACGCGGGCGGCTTCGGACCCGAGGACCGGCTGATGGCTGAGCGCGAGTACGGCTCCTGCAGCCACCACTACCAGCAGCTGCTGCAGAGCCTGGAACAGGGTGCACAGGAAGAGTCTCGCTGC
CAGCGCTGCATCTCCGAGCTCAAAGACATCCGGCTGCAGCTGGAGGCCTGTGAGACGCGCACCGTGCACCGCCTGCGGCTGCCGCTGGACAAAGAGCCGGCACGGGAGTGTGCCCAGCGCATC
GCCGAGCAGCAGAAGGCACAGGCAGAGGTGGAGGGGCTGGGCAAGGGGGTCGCCCGGCTCTCTGCCGAGGCCGAGAAGGTCTTGGCCCTACCAGAGCCATCGCCTGCGGCCCCCACGCTGC
GCTCGGAGCTGGAGCTGACGCTGGGCAAGCTGGAGCAGGTCCGCAGCCTGTCTGCCATCTACCTGGAGAAGCTCAAGACCATCAGCCTGGTGATCCGCGGCACGCAGGGGGCCGAGGAGGTGC
TCAGGGCCCACGAGGAGCAGCTCAAGGAGGCCCAGGCCGTGCCGGCCACCCTCCCGGAGCTCGAGGCCACCAAGGCCTCTCTGAAGAAGCTGCGGGCCCAGGCCGAGGCACAGCAGCCCACGT
TCGACGCCCTGCGGGATGAGCTGCGGGGGGCACAGGAGGTGGGGGAGCGACTGCAGCAGCGGCACGGGGAGCGGGACGTGGAGGTGGAGCGCTGGCGGGAGCGGGTCGCCCAGTTGCTTGA
GCGCTGGCAGGCTGTGCTGGCCCAGACCGACGTGCGGCAGCGCGAGCTCGAGCAACTGGGCCGCCAGCTGCGTTACTACCGCGAGAGTGCAGACCCCTTGGGCGCCTGGCTGCAGGACGCCAG
GCGGCGGCAGGAGCAGATCCAGGCCATGCCGCTGGCCGACAGCCAGGCTGTGCGGGAGCAGCTGCGGCAGGAGCAGGCCCTGCTGGAGGAGATCGAGCGCCACGGCGAGAAGGTCGAGGAG
TGCCAGAGGTTTGCGAAACAGTACATCAACGCCATCAAGGACTATGAACTCCAGCTGGTGACGTACAAGGCGCAGCTTGAGCCGGTGGCCTCCCCGGCCAAGAAGCCCAAGGTCCAGTCGGGATC
AGAGAGTGTCATCCAGGAGTACGTGGACCTGCGTACGCACTACAGCGAGCTGACCACACTGACGAGCCAGTACATCAAGTTCATCAGCGAGACTCTGCGGCGCATGGAGGAGGAGGAGAGGCTG
GCTGAGCAGCAGCGGGCAGAGGAGCGCGAGCGGCTGGCCGAGGTGGAGGCCGCGCTGGAGAAGCAGCGGCAGCTGGCCGAGGCGCACGCCCAGGCAAAGGCACAGGCGGAGCGGGAGGCG
AAGGAGCTGCAGCAGCGCATGCAGGAGGAGGTGGTGCGGCGGGAGGAGGCGGCGGTGGACGCGCAGCAGCAGAAGCGCAGCATTCAGGAGGAGCTGCAGCAGCTGCGGCAGAGCTCGGAGG
CGGAGATCCAGGCCAAGGCCCGGCAGGCAGAGGCGGCTGAGCGCAGCCGGCTGCGCATCGAGGAGGAGATCCGCGTGGTGCGCCTGCAGTTGGAGGCCACCGAGCGCCAGCGTGGCGGGGCT
GAGGGGGAGCTGCAGGCACTGCGTGCACGGGCGGAGGAGGCTGAGGCACAAAAGCGACAGGCGCAGGAGGAGGCCGAGCGCTTGCGGAGGCAGGTGCAGGACGAGAGCCAGCGTAAGCGG
CAGGCGGAGGTGGAGCTGGCCTCGCGCGTGAAGGCCGAGGCCGAGGCGGCGCGCGAGAAGCAGCGGGCCCTGCAGGCCCTGGAGGAGCTGCGGCTGCAGGCGGAGGAGGCGGAGCGGCGC
CTGCGGCAGGCCGAGGTGGAGCGAGCGCGGCAGGTACAGGTGGCCCTGGAGACGGCGCAGCGCAGTGCAGAGGCGGAGCTGCAGAGCAAACGCGCCTCCTTCGCCGAGAAGACGGCACAGCT
MEN2
GGAGCGCTCCCTGCAGGAGGAACACGTGGCTGTGGCACAGCTGCGGGAGGAGGCTGAGCGGCGGGCACAGCAGCAGGCCGAGGCCGAGCGGGCGCGCGAGGAGGCAGAGCGGGAGCTGGA
GCGCTGGCAGCTCAAGGCCAACGAGGCGCTACGGCTGCGGCTGCAGGCGGAGGAGGTGGCGCAGCAGAAGAGCCTGGCGCAGGCCGAGGCTGAGAAGCAGAAGGAGGAGGCGGAGCGCGAG
GCGCGGCGGCGCGGCAAGGCGGAGGAGCAGGCCGTCCGGCAGCGGGAGCTGGCTGAACAAGAGCTGGAGAAGCAGCGGCAGCTGGCGGAAGGCACCGCGCAGCAGCGCCTGGCCGCGGAGC
AGGAGTTGATCCGGCTGCGGGCCGAGACGGAGCAGGGGGAGCAGCAGCGGCAGCTGCTGGAGGAGGAGCTGGCCCGGCTGCAGCGTGAGGCGGCTGCAGCCACGCAGAAACGGCAGGAGCT
GGAAGCCGAGCTGGCCAAGGTGCGGGCCGAGATGGAGGTGCTGCTGGCCAGCAAGGCGAGGGCTGAGGAGGAGTCGCGCTCCACCAGCGAGAAGTCCAAGCAGAGGCTGGAGGCCGAGGCC
 Mutaciones desconocidas en un gen
BRCA1

NG_005905.2 81189 bp
NM_007294 7224 bp
AGTACCTTGATTTCGTATTCTGAGAGGCTGCTGCTTAGCGGTAGCCCCTTGGTTTCCGTGGCAACGGAAAAGCGCGGGAATTACAGATAAATTAAAACTGCGACTGCGCGGCGTGAGCTCGCTGAGACTTCCTGGACG
GGGGACAGGCTGTGGGGTTTCTCAGATAACTGGGCCCCTGCGCTCAGGAGGCCTTCACCCTCTGCTCTGGGTAAAGTTCATTGGAACAGAAAGAAATGGATTTATCTGCTCTTCGCGTTGAAGAAGTACAAAATGTCA
TTAATGCTATGCAGAAAATCTTAGAGTGTCCCATCTGTCTGGAGTTGATCAAGGAACCTGTCTCCACAAAGTGTGACCACATATTTTGCAAATTTTGCATGCTGAAACTTCTCAACCAGAAGAAAGGGCCTTCACAGTG
TCCTTTATGTAAGAATGATATAACCAAAAGGAGCCTACAAGAAAGTACGAGATTTAGTCAACTTGTTGAAGAGCTATTGAAAATCATTTGTGCTTTTCAGCTTGACACAGGTTTGGAGTATGCAAACAGCTATAATTTT
GCAAAAAAGGAAAATAACTCTCCTGAACATCTAAAAGATGAAGTTTCTATCATCCAAAGTATGGGCTACAGAAACCGTGCCAAAAGACTTCTACAGAGTGAACCCGAAAATCCTTCCTTGCAGGAAACCAGTCTCAGTGT
CCAACTCTCTAACCTTGGAACTGTGAGAACTCTGAGGACAAAGCAGCGGATACAACCTCAAAAGACGTCTGTCTACATTGAATTGGGATCTGATTCTTCTGAAGATACCGTTAATAAGGCAACTTATTGCAGTGTGGGAGATC
AAGAATTGTTACAAATCACCCCTCAAGGAACCAGGGATGAAATCAGTTTGGATTCTGCAAAAAAGGCTGCTTGTGAATTTTCTGAGACGGATGTAACAAATACTGAACATCATCAACCCAGTAATAATGATTTGAACACC
ACTGAGAAGCGTGCAGCTGAGAGGCATCCAGAAAAGTATCAGGGTAGTTCTGTTTCAAACTTGCATGTGGAGCCATGTGGCACAAATACTCATGCCAGCTCATTACAGCATGAGAACAGCAGTTTATTACTCACTAAA
GACAGAATGAATGTAGAAAAGGCTGAATTCTGTAATAAAAGCAAACAGCCTGGCTTAGCAAGGAGCCAACATAACAGATGGGCTGGAAGTAAGGAAACATGTAATGATAGGCGGACTCCCAGCACAGAAAAAAAGGT
AGATCTGAATGCTGATCCCCTGTGTGAGAGAAAAGAATGGAATAAGCAGAAACTGCCATGCTCAGAGAATCCTAGAGATACTGAAGATGTTCCTTGGATAACACTAAATAGCAGCATTCAGAAAGTTAATGAGTGGTTTTCC
AGAAGTGATGAACTGTTAGGTTCTGATGACTCACATGATGGGGAGTCTGAATCAAATGCCAAAGTAGCTGATGTATTGGACGTTCTAAATGAGGTAGATGAATATTCTGGTTCTTCAGAGAAAATAGACTTACTGGCCAG
TGATCCTCATGAGGCTTTAATATGTAAAAGTGAAAGAGTTCACTCCAAATCAGTAGAGAGTAATATTGAAGACAAAATATTTGGGAAAACCTATCGGAAGAAGGCAAGCCTCCCCAACTTAAGCCATGTAACTGAAA
ATCTAATTATAGGAGCATTTGTTACTGAGCCACAGATAATACAAGAGCGTCCCCTCACAAATAAATTAAAGCGTAAAAGGAGACCTACATCAGGCCTTCATCCTGAGGATTTTATCAAGAAAGCAGATTTGGCAGTTCAAAA
GACTCCTGAAATGATAAATCAGGGAACTAACCAAACGGAGCAGAATGGTCAAGTGATGAATATTACTAATAGTGGTCATGAGAATAAAACAAAAGGTGATTCTATTCAGAATGAGAAAAATCCTAACCCAATAGAATCACT
CGAAAAAGAATCTGCTTTCAAAACGAAAGCTGAACCTATAAGCAGCAGTATAAGCAATATGGAACTCGAATTAAATATCCACAATTCAAAAGCACCTAAAAAGAATAGGCTGAGGAGGAAGTCTTCTACCAGGCATAT
TCATGCGCTTGAACTAGTAGTCAGTAGAAATCTAAGCCCACCTAATTGTACTGAATTGCAAATTGATAGTTGTTCTAGCAGTGAAGAGATAAAGAAAAAAAAGTACAACCAAATGCCAGTCAGGCACAGCAGAAACC
TACAACTCATGGAAGGTAAAGAACCTGCAACTGGAGCCAAGAAGAGTAACAAGCCAAATGAACAGACAAGTAAAAGACATGACAGCGATACTTTCCCAGAGCTGAAGTTAACAAATGCACCTGGTTCTTTTACTAAGTG
TTCAAATACCAGTGAACTTAAAGAATTTGTCAATCCTAGCCTTCCAAGAGAAGAAAAAGAAGAGAAACTAGAAACAGTTAAAGTGTCTAATAATGCTGAAGACCCCAAAGATCTCATGTTAAGTGGAGAAAGGGTTTTGCAA
ACTGAAAGATCTGTAGAGAGTAGCAGTATTTCATTGGTACCTGGTACTGATTATGGCACTCAGGAAAGTATCTCGTTACTGGAAGTTAGCACTCTAGGGAAGGCAAAAACAGAACCAAATAAATGTGTGAGTCAGTGTGCA
GCATTTGAAAACCCCAAGGGACTAATTCATGGTTGTTCCAAAGATAATAGAAATGACACAGAAGGCTTTAAGTATCCATTGGGACATGAAGTTAACCACAGTCGGGAAACAAGCATAGAAATGGAAGAAAGTGAACTTGAT
GCTCAGTATTTGCAGAATACATTCAAGGTTTCAAAGCGCCAGTCATTTGCTCCGTTTTCAAATCCAGGAAATGCAGAAGAGGAATGTGCAACATTCTCTGCCCACTCTGGGTCCTTAAAGAAACAAAGTCCAAAAGTCACTTTT
GAATGTGAACAAAAGGCTGACTGCAGCCAGCCACAGGTACAGAGCCACAGGACCCCAAGAATGAGCTTACAAAGTGGCCTTTCCAGGCCCTGGGAGCTCCTCTCACTCTTCAGTCCTTCTACTGTCCTGGCTACTAAATATTT
 normal
1588 mutaciones
BRCA1-2
mutado
Riesgo
0.8
Portadoras
incrementado:
0.7 No portadoras El riesgo de CÁNCER DE
R 0.6
I
MAMA aumenta en
0.5
E
S 0.4
40 - 80% en portadoras de
G
0.3
mutación.
O
0.2
0.1
0 HEREDITARIO.
30 40 50 60 70 80
EDAD
 normal Riesgo de desarrollar cáncer < 5%
antes de los 80 años

APC
mutado Riesgo de desarrollar
2043 mutaciones
CÁNCER DE COLON
100 % antes de los 35
años.

HEREDITARIO.
APC

ATCGTGCCGCGTACTCC
 normal Respuesta FAVORABLE

KRAS
mutado POBRE ó NULA RESPUESTA
 ¿CÓMO PODEMOS ENCONTRAR UN GEN Y ESTUDIAR SU FUNCIÓN,
DE ENTRE EL TOTAL DE GENES DEL ORGANISMO?

Paul Berg Stanley N. Cohen Herbert Boyer

Los laboratorios de estos tres científicos produjeron técnicas de localización,

aislamiento, preparación y estudio de pequeños segmentos de DNA. Actualmente
estas técnicas hacen referencia al clonamiento de DNA.
Fundamentos de la clonación del DNA

La clonación del DNA implica la separación de un gen o

fragmento de DNA de su cromosoma, y la unión de esta a
una pequeña molécula portadora, para replicarla miles o
millones de veces.

Los pasos generales son:

1. Corte del DNA: enzimas de restricción.

2. Unión de fragmentos a vectores: DNA ligasa.
3. Selección de vectores de clonación (autorreplicación):
plásmidos.
4. Transferencia del ADN recombinante a células (vector +
ADN insertado): bacterias y levaduras.
5. Selección de células que contienen el ADN
recombinante.
Se encuentran en muchas especies bacterias. Werner Arber, descubrió
que su función biológica es reconocer y cortar DNA foráneo.

Existen tres tipos de endonucleasas de restricción:

 Tipo I: Corta el DNA azarosamente lejos del sitio de

reconocimiento (>1000 pb).
 Tipo III: Corta el DNA a 25 pb del sitio de reconocimiento.

Tanto la tipo I y III contienen varias subunidades y son endonucleasas y

metilasas a la vez. Además requieren ATP para su acción.

 Tipo II: Son homodiméricas. Cortan el DNA en la

misma secuencia de reconocimiento. No requieren
ATP. Reconoce secuencias de 4-8 pb.
Los sitios de restricción son palíndromos.
 El complejo entre EcoRI y su secuencia
diana implica la formación de 12 enlaces
de hidrógeno entre el sitio de
reconocimiento y seis residuos
amonioacídicos de la enzima (una Glu y
dos Arg en cada subunidad).

Nomenclatura Ejemplo Corresponde a:

E Escherichia Género de la bacteria
co coli Especie de la bacteria
R RY13 Cepa de la bacteria
La primera enzima Orden de identificación de la
I
identificada enzima en la bacteria
Enzimas de restricción y el clonamiento

Al vector se le agrega un
fragmento de ADN capa de ser
escindido por uno o varios tipos
de enzimas de restricción.
http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php

73
 Cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre el 5’-
fosfato de un nucleótido y el 3’-OH de otro.
 Requiere ATP.
 El más empleado deriva del bacteriófago T4, el cual también
puede ligar extremos romos, pero con menor eficiencia.
Otra enzima importante: LA FOSFATASA ALCALINA
Son portadores y transportadores de moléculas de DNA. Presentan
cuatro características importantes:

 Se replican por si mismos y al DNA foráneo (independiente)

 Contienen un número definido de sitios de restricción (uno por cada
tipo)
 Contiene un marcador seleccionable (gen de resistencia a
antibiótico)
 Fáciles de recuperar de las células hospederas.

En E. coli son comunes tres tipos de vectores de clonación: Plásmidos,

bacteriófagos y cósmidos.
 Plásmidos:

 Son naturalmente material

extracromosómico.

 Poseen un Ori.

 Se introducen en la célula mediante

“transformación inducida”. Permite la
clonación de hasta 10 000 pb.

 pBR322 (bajo número de copias)

 pUC18 (alto número de copias)
Blue-white screening
 Métodos de transformación
(Competencia inducida)

Tratamiento de E. coli con

altas concentraciones de Ca++
y choque térmico (menor
eficiencia que la competencia
natural).

Electroporación, campos de
pulso eléctrico que producen
poros de corta vida en la
membrana permiten la salida
y entrada del DNA.
Transformación con CaCl2

50 s 10 min
Transformación por electroporación
 Electroporación

• Causa la disrupción en la
membrana celular.
• Reconstitución de la membrana
lleva a la formación de grandes
poros que permiten la entrada
del DNA.
• Es utilizado para bacterias,
levaduras y otros eucariotes.
Genes marcadores de transformación
usualmente empleados
 Crecimiento en placas de agar

X-Gal = 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-galactoside
 Complementación-α

• La porción del gen lacZ que corresponde a sus

primeros 146 aminoácidos están en el plásmido
(porción alfa).

• El resto está en el cromosoma de la célula

hospedera.

• Si el gen lacZ del plásmido está intacto se

complementará con el cromosómico y generará
la β-galactosidasa activa.
 Bacteriófagos:

Puede introducir segmentos de ADN

más largos (20 000 pb).

Características del genoma del

bacteriófago λ (48 502 pb):

- Un tercio de su genoma no es
esencial.
- El genoma se empaqueta cuando
posee de 40 000 a 50 000 pb.

El segmento a clonar puede ser de

hasta 23 000 pb.
 Empleo del bacteriófago lambda como
vector de clonamiento

 El DNA del fago es extraído y el cluster

génico central es removido por digestión con
enzimas de restricción.

 El DNA foráneo es tratado con las mismas

enzimas de restricción y ligado al fago.

 Incubación con extracto crudo de células

infectadas (ensamblaje).

 Transducción con la célula bacteriana

hospedera.

 Los agujeros presentes la colonia

bacteriana (phage plaque) corresponde a
células lisadas por el fago.
 Cósmidos:

Infecta a la célula como un fago, pero

replica como un plásmido.

Clona fragmentos de hasta 45 000 pb.

Son moléculas de DNA pequeñas (5000 a

7000 pb) y circulares. Poseen

- Un Ori plasmídico.
- Uno o más marcadores seleccionables.
- Sitios de restricción únicos donde se
inserta el DNA foráneo.
- Sitio cos.
 LIBRERÍA GENÓMICA

¿Cómo logramos el clonamiento de un fragmento génico a partir de todo

un genoma?

Digestión con EcoRI Digestión con EcoRI

Transformación de células
con el vector
 Librerías Genómicas

 Los vectores son empleados para compilar una librería de fragmentos

de ADN aislados de una variedad de organismos.

 A partir de esta se puede aislar genes o secuencias específicas.

 El total de fragmentos de un genoma insertados en un vector e

incluidos en una células hospedera corresponde a una librería.

 Se puede realizar un screnning empleando sondas.

 Son empleados dos tipos de librerias de DNA: Genómicos y de cDNA.