Anda di halaman 1dari 54

UJI SARING IMLTD PADA

DARAH DONOR

Yuyun SM Soedarmono
Kementerian Kesehatan

1
KERANGKA BICARA
1. Pengamanan darah terhadap infeksi
2. Jenis agen IMLTD
3. Strategi uji saring IMLTD
4. Metoda uji saring IMLTD
5. Strategi pemilihan reagensia uji saring
IMLTD
6. Penutup

2
PENGAMANAN DARAH TERHADAP
INFEKSI
• Pengertian
– Pengamanan darah adalah upaya menjamin bahwa darah yang akan
ditransfusikan kepada pasien tidak akan menimbulkan reaksi.
• Salah satu reaksi transfusi adalah penularan infeksi yang dapat
ditularkan melalui transfusi darah (IMLTD) kepada pasien.
• Upaya menurunkan risiko IMLTD:
– Rekrutmen donor asal kelompok risiko rendah,
– Seleksi donor,
– Pengambilan, pengolahan, penyimpanan dan distribusi darah sesuai
standar,
– Di dalam pengolahan darah, upaya yang sangat penting adalah uji
saring infeksi,
– Uji saring infeksi harus dilakukan pada setiap kantong darah donor
menggunakan prosedur dan reagensia yang memenuhi standar kualitas.

3
DINAMIKA DINI DARI VIRAEMIA DAN MASA JENDELA

Busch MP et al. Transfusion 2005;45:254-264,AssalA et al. Transfusion 2009;49:289-300,


4
Weusten J et al, Transfusion 2011;51:203-15

4
JENIS AGEN IMLTD
• Parasit:
– Plasmodium
– Tripanosoma
• Plasmodium merupakan parasit yang dapat menginfeksi
sel darah merah sehingga menimbulkan infeksi malaria.
• Plasmodium ditularkan kedalam tubuh manusia melalui
vektor nyamuk anopheles.
• Dikenal beberapa spesies plasmodium dengan berbagai
jenis malaria yang ditimbulkannya.

5
6
VIRUS
• HIV, HBV dan HCV merupakan virus yang telah terbukti
dapat ditularkan melalui transfusi darah.
• Terdapat berbagai strain dari virus-virus tersebut di atas.
• HIV diketahui dapat menginfeksi sel darah putih,
diantaranya sel limposit T dan makrofag, dan
menimbulkan keadaan klinis AIDS.
• Sedangkan HBV dan HCV dapat menginfeksi sel hati
dan menimbulkan keadaan klinis hepatitis B dan C yang
memiliki kecenderungan untuk menjadi penyakit
hepatitis khronis.

7
ELECTRON MICROGRAPH OF HBV

Spheric HBsAg Tubular HBsAg 8


: 18-25 nm : 18-25 nm, l: 50-500 nm

8
Hepatitis B Virus
(Dane particle)

 Etiology of hepatitis B in
human
 Smallest human DNA virus,
a member of Hepadna
viridae
 42-nm double shelled DNA
virus
 outer component:
HBsAg
 Inner component:
HBcAg (27 nm)
 Circular double stranded
DNA
 DNA polymerase
9

9
GAMBARAN SEROLOGI PADA
INFEKSI HBV AKUT

WP 1 WP 2

Hr Hr
24* 38*

Gambaran serologis, biokimia dan virologis Hepatitis B Akut


(Bowden, 2002)
* Busch et al (2006), Kleinman et al (2007)
10

10
GAMBARAN SEROLOGI PADA
INFEKSI HBV KRONIS

WP

Hr Hr
24,6* 38,3*

Gambaran serologis, biokimia dan virologis Hepatitis B kronis


(Bowden, 2002)
* Busch et al (2006), Kleinman et al (2007) 11

11
HEPATITIS C VIRUS

• Family Flaviviridae
• Enveloped
• RNA-Virus

IRES
• Positive-sense single-stranded
(Internal Ribosomal Entry Site)
3’’-UTR
RNA (9.6 kb)
5’-UTR Open Reading Frame
• 3000-amino acid polyprotein

HVR1
HVR2
• One Open Reading Frame

12

12
Host

Efficient Protein synthesis

13

13
BAKTERI
• Treponema pallidum merupakan bakteri
berbentuk spiral yang dapat menginfeksi
berbagai organ tubuh.
• Infeksi treponema pallidum dapat merangsang
tubuh untuk membentuk antibodi terhadap
antigen treponema pallidum ataupun antibodi
terhadap kerusakan jaringan tubuh (reagin)

14

14
Treponema pallidum
subspecies pallidum
 Spirochaete
 0.1-0.2 µm Ø x 6-20 µm
 Pewarnaan khusus dan deteksi
mikroskopis diperlukan
 Parasite obligat pada manusia
 Venereal syphilis
 Distribusi global
 Insidensi bervariasi – tgt lokasi
geografi dan sosioekonomi
 Tidak ada daya imunitas
protektif
15

15
STRATEGI UJI SARING IMLTD
• Sampel untuk uji saring IMLTD
– Pengambilan sampel
– Pelabelan sampel uji saring IMLTD
– Pengiriman sampel uji saring IMLTD
– Penerimaan sampel uji saring IMLTD

• Algoritma uji saring


• Strategi proses uji saring
– Pooling assay serologi
– Uji saring berurutan (sequential)
– Uji saring pre-donasi
• Uji saring darah untuk fraksionasi plasma
• Uji saring darah pada keadaan darurat
16

16
Sampel untuk uji saring IMLTD
• Pengambilan sampel
– Tabung sampel dari plastik yang bertutup ulir, dengan ukuran 12x75 mm
dan volume minimal 5 ml
– Pengambilan sampel pd tabung dilakukan setelah selesai pengambilan
darah.
– Sampel dari lengan donor langsung ditampung dalam tabung tanpa
antikoagulan sampel serum atau tabung dengan antikoagulan
(biasanya digunakan EDTA atau sitrat sampel plasma.
• Pelabelan sampel uji saring IMLTD
– Nomor kantong darah atau barr code yang sama seperti barr code pada
kantong darah
– Golongan darah donor
– Tanggal dan jam pengambilan contoh darah
– Nama petugas pengambil sampel

17

17
• Formulir pengiriman sampel uji saring IMLTD
– Nomor urut
– Nomor sampel/nomor kantong darah/barr code sampel yang sama
seperti barr code pada kantong darah
– Kondisi sampel, apakah baik atau ada tanda-tanda lisis, lipemik, keruh
– Jenis sampel, apakah serum atau plasma
– Volume sampel
– Tanggal pengiriman sampel
– Tanggal penerimaan sampel

• Penerimaan sampel uji saring IMLTD


– pemeriksaan terhadap kondisi sampel yang diterima serta kesesuaian
antara data yang tertulis di dalam formulir pengiriman sampel dengan
data yang ada pada label di tabung sampel
– Validasi: td tgn pengirim dan penerima

18

18
ALGORITMA UJI SARING
Non Reaktif Lakukan uji saring Initial Reactive
(A) inisial (A) (A+)

Keluarkan darah & Pilihan 1 Pilihan 2


komponen darah (Sistim Kualitas tidak ada/terbatas) (Sistim Kualitas efektif)
yang dihasilkan Musnahkan darah dan komponen Ulangi uji saring in duplicate
darah yang dihasilkan dengan sampel dan asay yg sama

Negatif pada ke-dua Reaktif pda salah satu atau


pemeriksaan ulang Kedua pemeriksaan ulang
(A+, A-, A-) (A+, A+, A-) atau (A+, A+, A+)
Keluarkan darah & komponen Musnahkan darah dan
darah yang dihasilkan komponen darah yang dihasilkan
Kirim sampel untuk pemeriksaan
konfirmasi
A = Asay
A+ = Hasil reaktif pada asay A
A - = Hasil non reactive pada asay A 19

19
STRATEGI PROSES UJI SARING
• Pooling assay serologi:
– Tidak direkomendasikan
– Menghemat biaya
– Adanya risiko tidak terdeteksinya darah yang sebenarnya positif akibat
pengenceran atau adanya kesalahan akibat prosedur pooling yang tidak
berkualitas
• Uji saring berurutan (sequential):
– Tidak direkomendasikan
– Terlambatnya pengeluaran darah
– Tidak terdeteksinya donor dengan ko-infeksi
– Meningkatkan kemungkinan kesalahan penanganan sampel, darah dan
komponen darah
– Risiko dikeluarkannya darah yang belum diuji saring atau darah yang
tidak aman
– Tidak dapat dilakukannya studi epidemiologi tentang profil infeksi pada
donor
20

20
• Uji saring pre-donasi
– Tidak direkomendasikan
– Menghemat biaya khususnya untuk daerah prevalensi infeksi tinggi,
– Hasil tidak menjamin status infeksi, sehingga uji saring lanjutan tetap
harus dilakukan pada sampel yang diambil setelah menyumbangkan
darah, dan hal ini akhirnya akan makin meningkatkan biaya uji saring
– Meningkatkan penolakan terhadap calon donor
– Meningkatkan waktu menunggu donor sebelum dapat menyumbangkan
darahnya sehingga donor tidak nyaman
– Meningkatkan risiko diskriminasi
– Meningkatkan risiko stigmatisasi
– Tidak menunjang program donor reguler yang didasarkan atas donor
darah sukarela tanpa pamrih

21

21
• Uji saring darah untuk fraksionasi plasma
– Persyaratan dan algoritma uji saring darah
donor tergantung fraksionator

• Uji saring darah pada keadaan darurat


– Dapat dilakukan dengan assay Rapid, namun
jika memungkinkan sampel darah harus
segera di uji saring ulang menggunakan
assay EIA atau lainnya

22

22
PRINSIP UJI SARING DARAH
• Uji saring serologi
– Terhadap respon host
• Deteksi infeksi terhadap antibodi yang dibentuk
oleh host yang terinfeksi (umumnya Ab = IgG)
– Terhadap faktor agen infeksius
• Deteksi infeksi terhadap antigen dari agen yang
menginfeksi tubuh
• Uji saring molekuler
– Deteksi infeksi terhadap DNA/RNA agen yang
menginfeksi tubuh
23

23
METODA UJI SARING IMLTD
SEROLOGI:
1. Rapid Test
2. EIA (Enzyme Immuno Assay)
3. Chlia (Chemiluminescen)

MOLEKULER:
1. NAT (Nucleic Acid Test)
2. PCR
24

24
PRINSIP UJI SARING SEROLOGI
• Jika yang ingin dideteksi keberadaan Ab, maka
di reagensia deteksi mengandung Ag.
– Ikatan Ab-Ag akan dideteksi kembali dengan
anti-IgG yang ada pd konyugat
• Jika yang ingin dideteksi keberadaan Ag, maka
di reagensia deteksi mengandung Ab.
– Ikatan Ag-Ab akan dideteksi kembali dengan
Ag yang ada pd konyugat

25

25
UJI SEROLOGI Vs UJI MOLEKULER
• Uji Serologi:
– Mampu mendeteksi infeksi pada sebagain besar fase infeksi
– Tidak mampu mendeteksi infeksi pada masa jendela infeksi
dimana Ag dan atau Ab belum terdeteksi
– Uji serologi Ab, tidak mampu mendeteksi infeksi pada fase akhir
infeksi dimana tubuh sudah tidak mampu membentuk antibodi

• Uji Molekuler:
– Mampu mendeteksi infeksi pada masa jendela infeksi dimana Ag
dan atau Ab belum terdeteksi dan pade akhir infeksi dimana
tubuh sudah tidak mampu membentuk antibodi
– Tidak mampu mendeteksi infeksi saat Ab titernya tinggi ok
replikasi virus tertekan

26

26
Apa yg dimaksud dengan Rapid Test
Membran
• Rapid test adalah assay satu tahap yg
cepat dg tes yang simple, lengkap, non
invasif, untuk deteksi beberapa penyakit
infeksi dan non infeksi.
• Rapid Test mrp imunoasay membrane /
tes imunokromatografi yg memungkinkan
deteksi visual dari analit dalam spesimen
cair.
• Rapid test biasa digunakan sebagai tes
skrining awal.
27

27
PERSYARATAN RAPID TEST
• Dapat dipercaya / Akurat.
• Sensitivitas, Spesifisitas, Stabilitas tinggi.
• Hanya membutuhkan volume sampel yg
sedikit.
• Simple & mudah digunakan, disposable.
• Kecepatan aliran (< 5 menit).
• Murah.

28

28
3 format rapid test
Aglutinasi Flow through

Microparticle Cuvette
Test zone Control zone

Antigen
Monoclonal antibody
Absorbing pad

Lateral flow

29

29
Prospek penggunaan rapid test
untuk uji saring darah
• Tes dg performance yg baik dan cost rendah telah
tersedia
• Sudah termasuk control
• Tidak diperlukan peralatan dan listrik
• Mudah dipelajari dan dilakukan (<1 jam)
• Bisa pada keadaan sumber daya yg minim : tidak
ada / menurunkan cost untuk sampah
• Dapat digunakan saat pre- (<15 min) atau post-
donasi
• Digunakan di daerah dimana 70% penduduk dunia
berada
30

30
KOMPONEN DARI RAPID TEST
• Membran
• Sample pad / bantalan sampel
• Conjugate pad : di coated / dilapisi dg reagen
detektor (Ag/Ab yg berfungsi sbg indikator),
spesifik untuk bahan yg akan dianalisa (analit).
• Test band : coated pd membran dg reagen
capture, spesifik untuk analit.
• Control band : coated pd membran dg anti Ab
detektor, berperan untuk memvalidasi hasil test.
• Soak pad / bantalan penyerap
31

31
Komponen dari Rapid Test

Cover Pad
Sample Pad

Membrane Conjugate pad Test Band Control Band Soak pad

32

32
Reaksi Sandwich 1 (untuk deteksi antibodi)

Antibodi

Serum (Test Sample)

Synthetic Antigen

Membrane Membrane

Antibody-
Microparticle
Dalam konyugat
(anti-IgG & enzim)
33

33
Reaksi Sandwich 2 (untuk deteksi antigen)

Antigen (Test Sample)

Antibody-1

Membrane Membrane

Antibody-2-
Microparticle
34 Dalam konyugat
(anti-IgG & enzim)

34
ELISA TEST
• Elisa adalah tes serologi beberapa tahap yang
memerlukan peralatan
• Merupakan tes serologi yang ditetapkan sebagai
standar uji saring darah donor oleh WHO
• Bermanfaat untuk uji saring pada jumlah sampel
yang banyak (WHO: >60 sampel/minggu)

35

35
MENGAPA ELISA DIANJURKAN
• Lebih sensitif daripada Rapid test:
– Permukaan “solid phase” (sumur) yang dapat ditempeli
Ag/Ab lebih luas
– Reagen berbentuk cair yang lebih stabil
– Menggunakan konyugat yang bisa mengandung anti-
IgG atau Antigen
– Dilakukan pencucian untuk menghilangkan kontaminan
– Pembacaan dilakukan oleh spektrofotometer  lebih
akurat
– Hasil pembacaan stabil dan dapat diarsipkan
36

36
PROSEDUR ELISA
Contoh: Elisa untuk deteksi anti-HIV

3. Ditambahkan kojugat yg mgd Ag-HIV 


terjadi ikatan kompleks
Ag HIV-anti-HIV-Ag HIV  enzim aktif

2. Jika di dalam sampel tdp anti-HIV 


terjadi ikatan Ag-HIV dg anti-HIV

1. Di dasar well telah dilekatkan


Ag spesifik HIV

4. Enzim akan menguraikan khromogen di dalam substrat


menjadi warna  dilewatkan cahaya  diukur brp jlh cahaya
yang diserap oleh warna oleh spektrofotometer
37

37
TANTANGAN UNTUK PENERAPAN
ELISA
• Laboratorium (termasuk listrik dan sumber air)
• Tenaga
• Peralatan
– Mikropipet, Inkubator, Washer dan Reader
• Sampel
• Reagen
• Pencatatan, Pelaporan dan Dokumentasi
• QMS
– Quality Control
– Quality Assurance
– Quality Assessment
38

38
MENGAPA ELISA LEBIH
SENSITIF DARI RAPID
• Permukaan solid phase > luas
• Double detection oleh kojugat
• Reagen cair lebih stabil
• Pembacaan oleh spektrofotometer lebih
akurat dan stabil

39

39
MENGAPA CHLIA/CLIA
• CLIA adalah metoda untuk menetapkan konsentrasi analit
pada sampel berdasarkan intensitas dari luminescen yang
dikeluarkan akibat reaksi kimia
• Menggunakan “magnetic microparticle” sbg pembawa Ag dan
atau Ab  permukaan lebih luas, shg jumlah Ab/Ag yg
dibawa lebih banyak
• Pada CLIA dapat digunakan substrat berupa luminol,
isoluminol atau derivatnya atau derivat acridium ester 
mengeluarkan cahaya ketika ditambahkan reagen triger
• Umumnya menggunakan teknologi assay sandwich  jumlah
signal yg diukur secara proporsional langsung menunjukkan
jumlah analit yang ada pada sampel

40

40
• Keutamaan CLIA adalah dalam penggunaan
substrat yang memiliki aktifitas tinggi, lebih stabil
dan memiliki emisi cahaya lebih tinggi  jumlah
cahaya yg lebih banyak lebih mudah terukur 
lebih sensitif

• Proses kimia lebih stabil terhadap perubahan suhu


& pH

• Sistem deteksi tidak menggunakan cahaya dari


luar.
• Pengukuran photon dari reaksi chemiluminescence
menghindari masalah yg berkaitan dg filter dan
pemilihan panjang gelombang.
41

41
LIAISON XL murex HCV Ab – Test Format

Indirect 2 steps

STEP 1 p22 NS4


150µL diluent

NS4
p22
Incubation Wash with

+ C33
25µL Sample
(23’ - 66 cycles) Wash/System
liquid.

MP coated with HCV core


and NS4 rec Ag and C33 25µL Antigen
streptavidin-coated MP

STEP 2

150µL Tracer
Wash with

+ Incubation Wash/System liquid


(12’- 36 cycles)

Add the Starter Reagents


and measure the light
emitted

Assay Principles

42
STRATEGI PEMILIHAN REAGENSIA
UJI SARING IMLTD
• Sensitifitas >99,8%
• Spesifisitas >95%
• Format assay
• Ada kontrol
• Stabil
• Validasi
• Terdokumentasi
43

43
PERBANDINGAN UJI SARING SEROLOGI
PARAMETER RAPID EIA CHLIA
Solidphase Kertas Microplate Magneticparticle
nitroselulosa Permukaan Permukaanluas
pemukaan setengahbola
sempit
Conjugate Colloidalgold Ag/Ab/Anti-IgG Ag/Ab/Anti-IgG
berlabelenzim
Substrat Chromogendg Luminol,isoluminol
enzimakanberubah atauderivatnyaatau
menjadiwarna derivatacridiumeste
(reaksienzimatik) dgpenambahan
reagensiatriger
mengeluarkancahaya
(reaksikimia)
Pembacaan Visual Spektrofotometer Luminometerlebih
subyektif dipengaruhicahaya stabil

44

44
MENGAPA UJI SARING HARUS
SENSITIF ?
• Sensitifitas:
– Kemampuan suatu reagen untuk
menyingkirkan hasil yang negatif palsu
– Kemampuan suatu reagen untuk mendeteksi
sampel yang benar-benar reaktif
• Makin sensitif  kemungkinan hasil
negatif palsu lebih kecil  penting untuk
keamanan darah

45

45
Hambatan penggunaan rapid test
untuk uji saring darah
• Bervariasinya performans dan cost
• Perlu seleksi yg cermat ; banyak yg
performansnya buruk
• Harus yg sensitifitas dan spesifisitasnya
>99%
• Merujuk pada data evaluasi WHO yg
tersedia di Internet
• Hindari distributor yg menaikan harga 30-
100%
46

46
LABORATORIUM
• Luas memadai untuk menempatkan:
– Meja pencatatan
– Meja kerja
– Tempat cuci tangan
– Tempat cuci alat
– Peralatan Elisa dan Refrigerator reagen
– Ditempati sejumlah petugas yang bekerja

• Memenuhi persyaratan GMP


– Desain
– Aspek keamanan dan kenyamanan
– Ber-AC

47

47
TENAGA
• Kualifikasi:
– Teknisi Transfusi Darah
– Analis kesehatan
– ATD terlatih
• Jumlah, tergantung beban kerja:
– 1 org untuk sekitar 100 sampel untuk 4 parameter  Elisa semi
otomatik
– 1 org untuk sekitar 300 sampel untuk 4 parameter  Elisa
otomatik
• Jenis pelatihan yg diperlukan:
– Teknis Elisa
– QMS uji saring IMLTD

48

48
PERALATAN
• Mikropipet
– Harus dikalibrasi akurasi dan presisi vol nya dan
dibersihkan teratur
• Inkubator
– Harus dikalibrasi akurasi dan presisi suhu dan
pengatur waktunya dan dibersihkan teratur
• Washer
– Harus di bersihkan probe, selang dan tankinya secara
teratur
• Spektrofotometer
– Harus dibersihkan filternya, diganti lampunya secara
teratur
49

49
SAMPEL
• Wadah
• Kuantitas
• Kualitas
• Label
• Packing
• Transportasi
• Formulir pengiriman sampel

50

50
REAGEN
• Packaging insert
• Kuantitas
• Kualitas
• Validasi
– Eksternal:
• Kemasan, No. Lot, ED, Warna, Kekeruhan dan
Endapan dilihat secara visual
– Internal
• Di running terhadap sampel QC
• Dilihat OD kontrol negatif dan kontrol positifnya
51

51
PENCATATAN, PELAPORAN DAN
DOKUMENTASI
• Lembar kerja
• Lembar laporan
• Pengarsipan
• Dokumen penting:
– Kebijakan kualitas
– Manual kualitas
– PKS
– Instruksi kerja setiap alat
52

52
QMS
• Quality Control:
– Sertakan kontrol negatif dan kontrol positif kit pada
setiap plate
– Sertakan kontrol eksternal (bisa negatif atau positif)
saat ganti nomor lot, petugas, atau secara reguler
• Quality assurance:
– Validasi lab, tenaga, alat, reagen, dokumen
• Quality assessment:
– Pemantauan Mutu Internal = profisiensi test
– Pemantauan Mutu Eksternal  oleh provider

53

53
PENUTUP
• Uji saring IMLTD merupakan salah satu upaya
mengamankan darah
• Strategi uji saring IMLTD menentukan ketepatan
hasil
• EIA merupakan metoda uji saring yang
direkomendasikan
• Verifikasi dan validasi terhadap perangkat uji saring
harus dilakukan untuk akuntabilitas uji saring IMLTD
• QC dan QA merupakan aspek kuaitas yg harus
dilaksanakan

54

54