TES-TES

BIOKIMIA
OKSIDASE,
KATALASE,
KOAGULASE

Hesti RS

dr. Dean Handimulya SpPK

Tes Oksidase

Prinsip
Uji biokimia untuk menentukan
adanya enzim sitokrom
oksidase atau kadang disebut
juga sebagai indofenol oksidase
TMPD tetramethyl p
phenylenediamine
Tes Oksidase

– Reagen TMPD kaya akan elektron (tereduksi). Reagen ini tidak berwarna.
– Jika bakteri memiliki enzim sitokrom oksidase, masing-masing satu elektron dari 4
molekul sitokrom c akan ditransfer ke enzim sementara waktu
– Hal tersebut mengakibatkan terbentuknya 4 molekul sitokrom c yang masing-masing
kekurangan 1 elektron sementara enzim sitokrom oksidase kelebihan elektron
– Pada tahap akhir respirasi, enzim sitokrom oksidase memberikan 4 elektron ke
molekul oksigen dan bersama dengan 4 proton membentuk 2 molekul air. Dengan
demikian, enzim sitokrom oksidase akan kembali ke kondisi semula.
– Molekul TMPD yang kaya elektron memberikan elektron ke sitokrom c yang
kekurangan elektron. Sitokrom c akan kembali ke keadaan awal dan TMPD menjadi
kekurangan elektron. Radikal electron-poor (oxidized) TMPD berwarna biru gelap.
Tes Oksidase

Tujuan
mengetahui apakah bakteri menghasilkan enzim oksidase intraseluler.
Awalnya digunakan untuk mengidentifikasi Neisseria spp., selanjutnya digunakan
untuk membedakan Pseudomonas (oksidase positif) dari Enterobacteriaceae
(oksidase negatif). Satu-satunya spesies Enterobacteriaceae yang memiliki oksidase
ialah Plesiomonas shigelloides. Mayoritas bakteri Gram positif tidak memiliki
oksidase.
 Tes Oksidase-Prosedur

Ambil koloni murni dari biakan berumur 18-24 jam pada media padat yang
tidak mengandung gula dengan lidi kayu steril

Warna ungu Tidak ada

pada goresan warna ungu
Goreskan pada kertas saring Whatman yang sudah ditetesi reagen Kovacs kuman pada goresan
kuman

Perhatikan warna yang timbul pada goresan

Katalase

– Katalase/peroksidase adalah enzim yg merubah H2O2 menjadi H20 dan O2

– Hemoprotein, pH optimum untuk aktivitasnya 7.0
– Katalase dimiliki oleh bakteri yg memetabolisme karbohidrat secara aerob
untuk memecah H2O2 hasil produksi metabolisme. H2O2 dapat membunuh
bakteri (butuh enzim katalase).
Uji Katalase

Prinsip
Mendeteksi adanya enzim katalase pada bakteri
Tujuan
Membedakan Staphylococcus yg menghasilkan katalase dengan Streptococcus yg
tidak menghasilkan.
Tes Katalase : biochemistry
involved
– Ketika reduced flavoproteins atau reduced iron-sulfur proteins bergabung dengan
oksigen dan oksidase yang terdapat pada rantai pernafasan semua bakteri, maka
akan terbentuk 2 komponen toksik yaitu H2O2 dan radikal superoksida o2-
– H2O2 adalah produk akhir oksidatif pemecahan aerobic gula. Reduced flavoprotein
bereaksi langsung dengan gas oksigen melalui reduksi electron untuk membentuk
H2O2, bukan melalui kerja langsung antara hydrogen dan molekul oksigen. Catalase,
peroksidase, SOD catalytically scavenges the superoxide anion (O2-);catalase, H2O2.
Kedua enzim tersebut penting untuk pertahanan biologis melawan oxygen toxicity.
– 2H2O dengan bantuan enzim katalase jd H2o dan o2
Tes Katalase : biochemistry
involved
– Katalase dan SOD terdapat pada most cytochrome containing aerobic and
facultative anaerob respiring bacteria, dengan pengecualian utama adalah
Streptococcus spp. (lack catalase). Obligat anaerob lack both enzyme; most
anaerobic bacteria (Clostridium spp.) possesess peroxidase in lieu of catalase
– There are catalase that are heme proteins and others are found in
microorganism incapable of heme synthesis; they may be flavoprotein.
QC

– Hidrogen peroksida (superoksol) sangat tidak stabil dan melalui QC harian atau
segera sebelum penggunaannya. Kontrol + dan negative sebaiknya dikerjakan
secara simultan. Vigorous bubbling or foaming occurs indicating a positive
reaction when a drop of H2O2 diteteskan pada blood agar karena katalase pada
sel darah merah. Agar coklat dapat digunakan untuk kontrol negative karena sel
darahnya telah rusak.
– Tes katalase rutin, Mycobacterium catalase test negatif , Niacin +, reduksi nitrat
+ untuk M tb
– Qc dilakukan dengan menggunakan kuman kontrol positif (S. aureus) dan
kontrol negatif (Streptococcus sp)
Uji Katalase- Prosedur

CaraCara
Slide
Slide

Ambil 1 koloni
murni (telah
Tambahkan setetes
diinkubasi 18-24 Perhatikan
H2O2 30% (dengan
jam), menggunakan timbulnya
dropper/pipet
ose, lalu letakkan gelembung udara
Pasteur)
pada kaca objek
bersih
Uji katalase
Uji katalase metode slide
Uji Katalase- Prosedur

Inoklulat pada slant

Cara tabung agar (setelah inkubasi
(18-24 jam ) + 1 ml
H2O2 3%

Cara Tabung

Perhatikan timbulnya
gelembung udara
Uji katalase

Positif :
Staphylococcus
aureus
Kontrol
Negatf :
Streptococcus sp
Uji koagulase

Metode slide :mendeteksi bound coagulase (clumping factor),

metode tabung :mendeteksi free coagulase
Tujuan Tes Koagulase

Memeriksa dan mengetahui bilamana suatu bakteri menghasilkan enzim

koagulase.
Enzim koagulase dapat mengkatalisis pemecahan fibrinogen menjadi fibrin.
Bakteri yang menghasilkan koagulase mampu melindungi diri dengan cara melapisi
permukaan selnya dengan fibrin ketika berkontak dengan darah.
Fibrin tersebut akan melindungi bakteri dari fagositosis serta respon imun host
bakteri yang memiliki enzim koagulase lebih virulen dibandingkan yang tidak.
– dapat digunakan untuk membedakan antara Staphylococcus aureus yang
menghasilkan koagulase dengan Staphylococcus epidermidis dan spesies
Staphylococcus lainnya yang tidak menghasilkan koagulase
– S. aureus mampu menghasilkan koagulasi plasma EDTA pada uji koagulase
metode tabung, maupun menghasilkan gumpalan sel (clump of cells) pada uji
koagulase metode slide
Koagulase- Metode Slide

Suspensi sel bakteri dicampur dengan setetes plasma EDTA kelinci pada kaca slide.
Jika terdapat bound coagulase pada sel bakteri, fibrinogen di plasma akan diubah
menjadi fibrin sehingga sel bakteri akan menggumpal. Bound coagulase juga
merupakan adhesin, molekul adhesi kelompok MSCRAMM, yang menyebabkan sel
berikatan dengan fibrinogen dalam plasma. Pada pengamatan akan tampak
gumpalan bakteri di permukaan kaca slide.
Koagulase- Metode Tabung

– Uji metode tabung dilakukan dengan mencampur sel bakteri dengan plasma
dengan jumlah lebih banyak dalam tabung. Bakteri akan mensekresi
stafilokoagulase (free coagulase) ketika bermultiplikasi di plasma.
Stafilokoagulase akan membentuk kompleks dengan coagulase-reacting factor
(CRF), yang merupakan turunan atau modifikasi dari trombin. Kompleks
Stafilokoagulase-CRF akan berikatan dengan fibrinogen dan memecah
fibrinogen menjadi fibrin.
– CRF + Stafilokoagulase  kompleks Stafilokoagulase-CRF
– Kompleks Stafilokoagulase -CRF + fibrinogen  bekuan fibrin
– Hasil koagulase negatif dengan metode slide tidak dapat digunakan untuk
menyingkirkan kemungkinan infeksi oleh S. aureus, namun hasil negatif pada
metode tabung dapat menyingkirkan kemungkinan infeksi S. aureus.
Katalase

– Katalase/peroksidase adalah enzim yg merubah H2O2 menjadi H20 dan O2

– Hemoprotein, pH optimum untuk aktivitasnya 7.0
– Katalase dimiliki oleh bakteri yg memetabolisme karbohidrat secara aerob
untuk memecah H2O2 hasil produksi metabolisme. H2O2 dapat membunuh
bakteri (butuh enzim katalase).
Uji Katalase

Tujuan
Mendeteksi adanya enzim katalase pada bakteri
Membedakan Staphylococcus yg menghasilkan katalase dengan Streptococcus yg
tidak menghasilkan.