1

Kuliah 9

KLONING DNA

FFS-UHAMKA Tim Dosen Biologi Molekuler

 MATERI BIOLOGI SEL MOLEKULER
2

 TM 1. Pendahuluan
 TM 2. Sistem transport membran dan endomembran
 TM 3-4. Dogma central
 TM 5-6. Ekspresi Gen
 TM 7. Pustaka DNA
 TM 8. Komunikasi sel
 TM 9. Kloning
 TM 10. PCR
 TM 11. Rekombinasi DNA dan Rekayasa Genetika
 TM 12. Human Genom
 TM 13. Produk rekombinan di bidang Farmasi
 TM 14. Aplikasi Biomol utk kesehatan
 Kloning DNA
3

 Klon berasal dari bahasa Latin yang berarti cabang atau batang
 Klon didefinisikan sebagai organisme yang identik secara genetik
 Kloning dalam Biologi : proses perbanyakan individu yang secara
genetik identik (scr alamiah tjd pd bakteri, insekta, tanaman)
 Proses memproduksi dalam jumlah banyak fragmen DNA yang identik
 Tujuan:
 Memperbanyak fragmen DNA yang identik
 Mengisolasi fragmen DNA yang dikehendaki
 Melokalisasi DNA (Gen) dari kromosom
 Mentransfer DNA dari satu individu ke individu lain

 Teknik :
 Kloning bakteria (DNA Bacterial Cloning)
 Amplifikasi PCR (DNA PCR amplification)
 Kloning DNA
4

 Kloning DNA menggunakan jasa Bakteri sebagai HOST (inang) untuk

menggandakan DNA yang diinginkan melalui proses Replikasi
 Kloning DNA Bakterial memerlukan :
 Fragmen DNA atau Gen  Enzim Ligase
 Enzim Restriksi  Sel Bakteri Kompeten

 Vektor Kloning DNA  Medium Kultur Bakteri Seleksi

1. Fragmen DNA atau Gen
 Genom
 Kromosom bakteri
 Gen spesifik pada virus, bakteri
 Gen spesifik pada organisme eukariot
 cDNA (complementary DNA)
2. Enzim Restriksi
 Enzim restriksi = enzim DNA endonuklease
 Berfungsi memotong DNA pada situs dengan sekuens basa tertentu
(situs restriksi)
 Sekuens basa yang dikenali oleh enzim DNA endonuklease bersifat
palindrom
 Enzim restriksi digunakan untuk :
 Memotong DNA/gen yang dikehendaki
 Memotong plasmid sirkuler menjadi linier

 Dua macam DNA endonuklease:

 Memotong lancip (stagered end, flanking end, sticky end)
 Memotong tumpul (blunt end)
 Enzim Restriksi
7

 EcoRI - from Escherichia coli

BamHI - from Bacillus amyloliquefaciens
HindIII - from Haemophilus influenzae
PstI - from Providencia stuartii
Sau3AI - from Staphylococcus aureus
AvaI - from Anabaena variabilis
Penamaan Enzim Restriksi

Genus Epiteton specificum

Escherichia coli RY13 Strain

E co R I Nomor
enzim yang
dihasilkan
 Enzim Restriksi
9

Source microorganism Enzyme Recognition Site Ends produced

Arthrobacter luteus Alu I AGØCT Blunt

Bacillus amyloiquefaciens H Bam HI GØGATCC Sticky

Escherichia coli Eco RI GØAATTC Sticky

Haemophilus gallinarum Hga I GACGC(N)5Ø Sticky

Haemophilus infulenzae Hind III AØAGCTT Sticky

Providencia stuartii 164 Pst I CTGCAØG Sticky

Nocardia otitiscaviaruns Not I GCØGGCCGC Sticky

Staphylococcus aureus 3A Sau 3A ØGATC Sticky

Serratia marcesans Sma I CCCØGGG Blunt

Thermus aquaticus Taq I TØCGA Sticky

 3. Vektor Kloning
 Suatu segmen kecil DNA yang
digunakan untuk membawa
segmen DNA lain ke dalam suatu
sel
 Suatu molekul DNA sirkuler yang
dapat membawa segmen DNA
asing ke dalam sel,
mereplikasikannya di dalam sel
bakteri (atau yeast) dan
menghasilkan jumlah yang sangat
banyak
Tipe Vektor Kloning DNA

Perkiraan panjang maksimum DNA yang dapat diklon pada vektor

Maksimum panjang
Tipe Vektor DNA yang dapat
diklon (kb)
Plasmid 20
λ Phage 25
Cosmid 45
P1 phage 100
BAC (bacterial artificial chromosome) 100 – 500
YAC (yeast artificial chromosome) 250 – 1000
 Vektor DNA

1. Plasmid 2. Phage DNA

Extract
Extract

Bacteria Phage
Vektor Plasmid
Vektor Bakteriofaga
 Vektor Kloning DNA
15

 Vektor Kloning adalah molekul DNA yang digunakan untuk

"transport" fragmen/sekuens DNA ke dalam sel inang.
 Vektor umumnya mempunyai 4 sifat umum:
1. Kemampuan ber replikasi sendiri (otonom) di dalam sel inang.
2. Mengandung suatu genetic marker yang berguna untuk seleksi.
3. Mempunyai situs restriksi yang unik untuk memfasilitasi kloning insert
DNA.
4. Sejumlah nonessential DNA minimum yang berguna untuk optimasi
proses kloning DNA.
 Contoh Vektor Plasmid
16
 Contoh Vektor Plasmid
17
18
19
4. Enzim Ligase
 Enzim DNA ligase = ditemukan pada semua sel (prokariot &
eukariot) saat terjadi replikasi DNA
 Merupakan enzim yang spesifik untuk menfasilitasi penyambungan
fragmen DNA dengan mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester
 Berfungsi menyambungkan potongan DNA hasil pemotongan oleh
enzim restriksi
 Hasil penyambungan :
 Plasmid rekombinan
 Plasmid religasi

 Fragmen DNA/gen religasi

 5. Sel Bakteri Inang
21

 Sel inang yang umum digunakan untuk rekayasa genetika adalah

Escherichia coli, karena keseluruhan genomnya sudah diketahui
 Sel inang harus dijadikan SEL KOMPETEN
 Sel Kompeten adalah kondisi sel inang yang siap untuk ditransformasi
oleh potongan DNA atau plasmid rekombinan hasil ligasi
 Menjadikan kompeten dengan cara ditambahkan CaCl2 dan
ditempatkan pada suhu 0 - 4oC
 5 Langkah Strategi Kloning DNA
22

1. Enzyme restriction digest of DNA sample.

2. Enzyme restriction digest of DNA plasmid vector.
3. Ligation of DNA sample products and plasmid vector.
4. Transformation of E. coli with the ligation products.
5. Cloned Selection by growth on agar plates with selection for
antibiotic resistance
 Langkah 1
Enzyme restriction digest of DNA sample

23
 Pemotongan DNA
24
 Langkah 2
Enzyme restriction digest of DNA plasmid vector

25
 Langkah 3
Ligation of DNA sample products and plasmid vector

26
 Ligasi
27

 Proses penyambungan
dua fragmen DNA
menjadi satu fragmen
yang dikatalisis oleh
enzim DNA ligase
Proses Ligasi memerlukan
 Enzim DNA Ligase
Suatu reaksi yang menyambungkan potongan fragmen DNA ke
dalam plasmid kloning.
 Fragmen DNA
Potongan DNA dari proses restriksi baik yang bersifat ujung tumpul
(blunt end) maupun yang ujung lancip (sticky end).
 ATP
Donor posfat untuk membentuk ikatan fosfodiester
Tahapan Ligasi
 Langkah 4
Transformation of E. coli with the ligation products

30

A. Chemical transformation with Calcium Chloride

 Langkah 4
Transformation of E. coli with the ligation products

31

B. Transformation by electroporation
 Langkah 5
Growth on agar plates (Amp+X-Gal) and selection for antibiotic resistant
colonies

32
 Cloning DNA experiment
33
34