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Continuación

UNIDAD 3
 Inventada Mikhail Tswett (1900) para
separar distintos pigmentos de la clorofila
pasándola por una columna de carbonato de
calcio.
Es la separación
de dos o más
compuestos
químicos en un
medio
Fase Móvil: Gas ó Líquido
Fase Estacionaria: Inmiscible; es
sólido o líquido fijado en un sólido.
La movilidad de los componentes de
la mezcla a separar depende de la
afinidad química o propiedades / FE
& FM

Si 1 Componente tiene propiedades


químicas = FM, tendrá gran
movilidad, es decir, el efecto de
retención que provocaría la fase
estacionaria sería nulo.

El Desplazamiento diferencial de los


solutos (Fenómeno de adsorción) al
ser arrastrados por una FM sobre una
FE, nos permite identificar cuantos
componentes tiene una mezcla.
 Cromatografía plana.
FE=Placa plana o papel
 Cromatografía en papel
 Cromatografía en capa fina

 Cromatografía en columna.
 Cromatografía en columna.
FE=Columna
 Según el fluido empleado:
 Cromatografía de Líquidos
 Cromatografía de Líquida de Intercambio Iónico
 Cromatografía de Líquida de alta eficiencia
 Cromatografía de Líquida de Exclusión
 Cromatografía de Líquida de Adsorción
 Cromatografía de Líquida en fase Inversa y Normal
 Cromatografía de Gases
 Cromatografía de líquidos súper críticos
FE= papel de celulosa.
FM= disolvente y la mezcla de
varios líquidos que contiene
agua o solvente.
Se aplica la muestra sobre el papel
Introducción del papel en la cubeta que
contiene el disolvente.
Éste atraviesa el papel por capilaridad
arrastrando los componentes de la
mezcla.
Separación en función de la afinidad por las dos
fases, las más solubles en agua se quedarán cerca del
punto donde se aplicó la muestra, y las menos
solubles en agua y más solubles en el disolvente
llegarán más lejos.
Las sustancias separadas se identifican mediante
diversos procedimientos físicos o químicos.
• Transcurridos unos
• Con la ayuda de un
capilar de vidrio, 2 minutos, cuando el
frente del disolvente
una pequeña se encuentra próximo
cantidad de • Una vez depositada al extremo de la
muestra se la muestra, se placa, se saca ésta de
deposita sobre el introduce la placa la cubeta, se deja
adsorbente, muy en una cubeta de secar. Los diversos
cerca del extremo cromatografía, que compuestos se
inferior de la contiene en el localizan
placa. interior el directamente si son
disolvente con el coloreados, o con la
que va a ayuda de un
1 desarrollarse
cromatograma.
el indicador o luz
ultravioleta, si son
incoloros

3
Los compuestos que avanzan a lo largo
de la placa se ven atraídos por fuerzas
sobre la superficie del adsorbente,
interaccionando el disolvente con
ambos.

Esta interacción competitiva establece


las velocidades relativas con que
ascienden por la capa de adsorbente,
el frente de disolvente y un
determinado compuesto. Cuanto mayor
es la polaridad de los compuestos, más
intensamente se ven éstos atraídos por
 Eluyentes mas
comúnes:  Adsorbentes más
comunes:
 éter de petróleo
 Tolueno  Silica gel (se utiliza en
 dietil-éter, t-butil-éter el 80% de las
 Diclorometano separaciones)
 acetato de etilo  b) Óxido de Aluminio ó
 n-pentano, n-hexano Alúmina (ácida, neutra
 Ciclohexano ó básica)
 tetracloruro de carbono
 c) Celulosa (Nativa o
 éter dietílico
micro-cristalina)
 Cloroformo
 Acetona
 d) Poliamidas
 Iso-propanol
 Etanol
 Metanol
Limpieza de Temperatura
las Placas

Pureza de los
disolventes
 La separación por cromatografía de intercambio
iónico depende de la adsorción reversible de una
molécula de soluto cargada a un grupo de
intercambiadores iónicos inmovilizados de carga
opuesta.

FE = resina de intercambio iónico que contiene grupos


cargados.
FM = generalmente una solución amortiguadora de pH
 cc
Equilibrio de la
matriz • pH, fuerza iónica
Adsorción de la
muestra
Comienzo de la
remoción

Fin de la remoción

Regeneración de la
matriz
 Fuertes: permanecen ionizadas en todo el
rango útil de pH.
 Débiles: disminuyen su ionización en función
del pH.
-Gran sensibilidad
-Determinaciones cuantitativas exactas
-Determinación de compuestos no volátiles
(alto Peso Molecular, iones metálicos) o
termolábiles.

-El sistema HPLC requiere una mezcladora


de solventes, un inyector, y una bomba que
inyecte el líquido a la columna.
- La fase móvil fluye a través de la columna
estrechamente empaquetada.
-Presiones de hasta 1500 – 2000 PSI.
-Tiempo de análisis reducido.

-Los eluidos se identifican al abandonar la


columna por métodos:
UV Índice de Refracción Fluoresencia
Resolución Velocidad Sensibilidad
Elevada elevada

Pequeña Limita
capacidad purificaciones a
gran escala
 Pureza de materias primas
 Industria farmacéutica
 Productos de degradación
 Metabolitos en medicamentos en muestras biológicas
 Análisis toxicológicos
 Análisis de muestras medioambientales
-Fase Estacionaria:
El material que llena la columna (gel
o resina) está formado por partículas
con poros de un cierto intervalo de
tamaños.

-Las moléculas mayores que los poros no


pueden entrar en ellos, por lo que "pasan de
largo" y avanzan por la columna (eluyen) con
mayor rapidez que las de tamaño menor, que
pueden entrar en los poros y así realizan un
recorrido mayor, progresando más lentamente
a lo largo de la columna.
 DETERMINACIÓN DE MASAS MOLECULARES

 DETERMINACIÓN DE ESTRUCTURA 3ª Y 4ª DE
PROTEÍNAS PURIFICADAS
 Las moléculas se fijan sobre sustancias insolubles:

 Alúmina (Al2O3)
 Carbón activado
 Tierra de Diatomeas (Kieselguhr)
 Sacarosa pulverizada
 Gel de sílice

 Asociaciones de Van der Waals

 Enlaces H O
 Eluyente:

Hexano

 Separa substancias No Polares

 Columna polar – Disolvente no polar


Fase inversa (FI)
– Fase móvil polar/ Fase estacionaria no polar

Fase normal (FN)


– Fase móvil no polar/ Fase estacionaria polar
 Es la más utilizada actualmente.
 La separación se basa en interacciones
hidrofóbicas entre grupos hidrocarburo de la fase
estacionaria y del analito.
 Componentes más polares eluyen primero.
 La retención aumenta cuando aumenta la
hidrofobicidad del analito.
 Sílica con hidrocarburos saturados,
insaturados o aromáticos de
diferentes tipos.

Más empleados:
•octadecil (C18)
•octil (C8).

Cuanto mayor es el #C, mayor es la


eficacia.
 Agua o solución buffer con:
 Metanol
 Acetonitrilo
 Tetrahidofurano
 Acetato de etilo
 Acetona
Cuanto menos polar es el disolvente, más fuerza eluyente tiene
 Elimina las colas de los picos.
 Menos sensible a impurezas en el eluyente.
 Se ha adaptado uso de columnas.
 HPLC: alta presión para mejorar la resolución y
reducir los tiempos de separación.
 Separación compuestos
 Farmacéuticos
 Bioquímicos
 Forenses
 Clínicos
 Industriales

 Purificacion de biomoleculas
 proteínas y péptidos.
 oligonucleótidos
 Desalado
 Analisis cuantitativo
 Primera descrita, menos utilizada
 Basada en interacción de los analitos con grupos
funcionales polares de la superficie de la fase
estacionarial originada por fuerzas eléctricas
entre dipolos permanentes o inducidos.
 El componente menos polar se eluye primero,
debido a que es el más soluble en la fase móvil

Un aumento de la polaridad de la fase


móvil, hace disminuir el tiempo de elución.
Fase móvil
apolar

Solventes muy
apolares:
Sílica con grupo: • hexano
 grupo ciano • heptano
 diol mezclados con
 amino
solventes más
polares:
 dietilamino
• isopropanol
• cloroformo
• etilacetato

La fuerza de elución de la fase


móvil de modifica con n-hexano.
 Herramienta de separación muy potente debido a
la amplia gama de eluyentes disponibles que se
pueden utilizar para ajustar con precisión la
selectividad de una separación.
 Se ha dejado de utilizar debido a su complejidad.
 Período de equilibrado prolongado
 Problemas de reproducibilidad
 Sensibilidad de la técnica a presencia de pequeñas
concentraciones de contaminantes polares en la fase
móvil.
 Si esto se controla, se obtiene cromatogramas
mejores a los de fase reversa debido a la baja
viscosidad de los eluyentes que se utilizan
habitualmente.
 Separación de:
Analizar trazas de sustancias potencialmente
cancerígenas y mutagénicas en aire, agua y efluyentes.

 PAHs (Hidrocarbonos Policíclicos Aromáticos).


 Lípidos
 Alcanos
 Esteroides
 Azúcares
 Es la técnica para la separación de
compuestos orgánicos e inorgánicos
térmicamente estables y volátiles
 Se produce como consecuencia de la
interacción de los componentes de una
mezcla vapor en una fase móvil gaseosa
inerte, con una fase estacionaria
(sólido/líquido) de alto punto de ebullición
sobre un sólido inerte
 Gas portador: Medio de transporte de los componentes de la
mezcla a través del sistema cromatográfico.
Debe ser inerte: Ar, He, N2
 Columnas
Capilares:
Sílice fundida.
Diámetros interiores: 200-250 mm.
Longitud < 20 m.
Micro-empacadas
Tubulares abiertas
Empaquetadas
Tubo de acero inoxidable, niquel
o vidrio.
Diámetros interiores 1,6 -9 mm.
Longitud > 3 m.
Se rellenan de un material adsorbente
adecuado.
A MENOR DIÁMETRO, MAYOR EFICIENCIA Y RESOLUCIÓN

EL INCREMENTO DE LA LONGITUD DE LA COLUMNA INCREMENTA EL


NÚMERO DE PLATOS TEÓRICOS, Y ASÍ LA RESOLUCIÓN
Fases estacionarias
Separaciones por punto de ebullición de compuestos
en un intervalo amplio de pesos moleculares:
Escualano
Polidimetilsiloxano
Para hidrocarburos insaturados y otros compuestos
polidifenildimetilsiloxano
policarboranometilcianoetilsilicón
Para compuestos nitrogenados
poliamida
policianoetilmetilsilicon
Para alcoholes, ésteres, cetonas y acetatos
polietilenglicol
pentaeritritol tetracianoetilado
Conductividad
Detector de captura
térmica
de electrones (ECD)

Espectroscopía de
masas
Cromatografía líquidos supercríticos

La Tc de una sust. es la
temp. por encima de la
cual no puede existir en
fase liquida
independientemente de la
presión.
La Pc es presión de vapor de
una sust. a su Tc.
Una sustancia a T y P por
encima de su Tc y Pc
(punto critico) =
FLUIDOS SUPERCRITICOS
Es una modalidad híbrida entre cromatografía de
gases y de líquidos que combina mejores
características de cada una de ellas y permite la
separación y determinación de compuestos que no
son manipulados esas cromatografías.

Compuestos con grupos


Compuestos no volátiles o funcionales no detectables
térmicamente lábiles por técnicas
para los que la espectroscópicas o
cromatografía de gases es electroquímicas
inaplicable. empleadas en
cromatografía de líquidos.
Equipo instrumental de cromatografía de fluidos
supercríticos.

Parecido al de HPLC con los mismos límtes de temperatura y presión


•Horno: mantener la columna termostatizada y controlar la
temperatura de la fase móvil.

• Restrictor (contrapresión): mantener la presión en la


columna y convertir el eluyente, de fluido supercrítico en un
gas, y arrastrarlo al detector.
Un restrictor para columna tubular abierta de 50 -100 μm
consiste en un capilar de 2 -10 cm. De longitud y 5 - 10 μm de
diámetro el cual esta directamente unido al extremo final
de la columna

•Microprocesadores: permiten control de variables


instrumentales.

•Detectores :ionización de llama  respuesta universal a


compuestos orgánicos, de elevada sensibilidad .
Los espectrómetros de masas se pueden adaptar como
detectores mas fácilmente para SFC que para HPLC.
Fase móvil
Columnas CO2
abiertas: similares a Disolvente excelente
las columnas de para moléculas
sílice fundida con orgánicas no polares.
recubrimientos
Tc = 31º ; Pc =72.9
internos de varios atm.
tipos de siloxanos
Lo cual permite
enlazados y de
trabajar con una banda
enlaces cruzados. amplia de
Columnas temperaturas y
rellenas. presiones.
Separación de:

* Fármacos * Tensoactivos
* Alimentos * Polimeros
* Pesticidas * Explosivos
* Herbicidas * Propelentes

FIN