ROMATOGRAFI KOLOM

Oleh Kelompok I :
• Istilah kromatografi berasal dari kata latin chroma berarti warna dan
graphien berarti menulis. Kromatografi pertama kali diperkenalkan
oleh Michael Tsweet (1903) seorang ahli botani dari Rusia. Michael
Tsweet dalam percobaannya ia berhasil memisahkan klorofil dan
pigmen-pigmen warna lain dalam ekstrak tumbuhan dengan
menggunakan serbuk kalsium karbonat yang diisikan ke dalam kolom
kaca dan petroleum eter sebagai pelarut. Proses pemisahan itu
diawali dengan menempatkan larutan cuplikan pada permukaan atas
kalsium karbonat, kemudian dialirkan pelarut petroleum eter. Hasilnya
berupa pita-pita berwarna yang terlihat sepanjang kolom sebagai hasil
pemisahan komponen-komponen dalam ekstrak tumbuhan
• Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan
perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk
memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan.
Definisi lain dari kromatografi adalah proses melewatkan sampel melalui
suatu kolom, perbedaan kemampuan absorpsi terhadap zat-zat yang
sangat mirip mempengaruhi resolusi zat terlarut dan menghasilkan apa
yang di sebut kromatogram. Pada dasarnya, semua kromatografi
menggunakan dua fase yaitu satu fase tetap (stationary) dan yang lain
fase bergerak (mobile). Pemisahan-pemisahan tergantung pada gerakan
relative dari dua fase ini. Cara-cara kromatografi dapat digolongkan sesuai
dengan sifat-sifat fase tetap, yang dapat berupa zat padat atau zat cair
• Kromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom
sebagai alat untuk memisahkan komponen-komponen dalam
campuran. Alat tersebut berupa pipa gelas yang dilengkapi suatu kran
dibagian bawah kolom untuk mengendalikan aliran zat cair, ukuran
kolom tergantung dari banyaknya zat yang akan dipindahkan. Secara
umum perbandingan panjang dan diameter kolom sekitar 8:1
sedangkan daya penyerapnya adalah 25-30 kali berat bahan yang akan
dipisahkan. Teknik banyak digunakan dalam pemisahan senyawa-
senyawa organik dan konstituen-konstituen yang sukar menguap
sedangkan untuk pemisahan jenis logan-logam atau senyawa
anorganik jarang dipakai (Yazid, 2005, hal: 98).
A. Metode dan Instrumen Kromatografi Kolom

1. Metode Kromatografi Kolom

Teknik pemisahan kromatografi kolom partisi sangat mirip dengan kromatografi kolom adsorpsi. Perbedaan
utamanya terletak pada sifat dari penyerap yang digunakan. Pada kromatografi kolom partisi penyerapnya
berupa materi padat berpori seperti kieselguhr, selulosa atau silika gel yang permukaannya dilapisi zat cair
(biasanya air). Dalam hal ini zat padat hanya berperan sebagai penyangga (penyokong) dan zat cair sebagai
fase diamnya. Fase diam zat cair umumnya diadsorpsikan pada penyangga padat yang sejauh mungkin inert
terhadap senyawa-senyawa yang akan dipisahkan. Zat padat yang penyokong harus penyerap dan menahan
fase diam serta harus membuat permukaannya seluas mungkin untuk mengalirnya fase bergerak. Penyangga
pada umumnya bersifat polar dan fase diam lebih polar dari pada fase bergerak. Dalam kromatografi partisi
fase bergeraknya dapat berupa zat cair dan gas yang mengalir membawa komponen-komponen campuran
sepanjang kolom. Jika fase bergeraknya dari zat cair, akan diperoleh kromatografi partisi cair-cair. Teknik ini
banyak digunakan untuk pemisahan senyawa-senyawa organik maupun anorganik
2. Intrumen Kromattografi Kolom
Ciri khas dari kromatografi kolom adalah penggunaan sebuah tabung
kaca kolom dengan diameter 5 hingga 50 mm dan tinggi 5 cm hingga 1
meter sebagai wadah bahan fase stasioner (bagian yang diam). Bahan
campuran (larutan) masuk melalui sisi atas tabung dan mengalir
perlahan melewati bahan stasioner. Zat-zat penyusun campuran akan
terpisah berdasarkan kecepatannya mengalir di dalam bahan stasioner.
Zat yang paling cepat mengalir akan mencapai bagian outlet tabung
terlebih dahulu, dan diikuti dengan zat-zat yang lainnya
• Prinsip kerja kromatografi kolom
terletak pada bahan stasioner
yang digunakan, yaitu berupa
silica gel atau juga alumina.
Serupa dengan alumina, silica gel
memiliki struktur kimia inti
silikon dioksida, dimana atom
silikon berikatan dengan oksigen
dan membentuk struktur
kovalen besa
Jenis-jenis Kromatografi Kolom
1. Berdasarkan interaksi komponen dengan adsorben, kromatografi dapat dibedakan menjadi
menurut Alimin (2007) yaitu :
a. Kromatografi adsorbsi
b. b.Kromatografi partisi
c. Kromatografi petukaran ion
d. d.Kromatografi filtrasi gel
2. Berdasarkan gaya yang bekerja pada kolom, kromatografi dapat dibedakan menjadi menurut
Marston (1995) yaitu :
e. a.Kromatografi kolom gravitasi
f. b.Kromatografi kolom tekanan
3. Berdasarkan jenis fasa diam dan fasa gerak, kromatografi dapat dibedakan menjadi menurut
Bernaseoni (2005) yaitu :
g. Kromatografi fase normal
h. Kromatografi fase terbaliik
E.Komponen Dalam Kromatografi
Kolom
1. Adsorben
Silika gel (SiO2) dan alumina (Al2O3)
adalah 2 adsorben yang paling umum
digunakan untuk kromatografi kolom.
2. Pelarut
Pelarut mempunyai peranan yang
penting dalam mengelusi sampel
yang dapat menentukan keberhasilan
pemisahan secaa kromatografi kolom
• 3. Syarat-syarat Adsorben dan Pelarut
Suatu adsorben dan pelarut dalam suatu kromatografi kolom, memiliki suatu
syarat-syarat menurut Sudjadi (1988) antara lain :
a. Harus memiliki luas permukaan besar internal. Kecepatan adsorbsi akan
semakin bertambah dengan semakin kecilnya ukuran diameter adsorben.
b. Harus mudah diregenerasi.
c. Tidak cepat kehilangan kapasitas serap.
d. Pemilihan pelarut tergantung dari sifat kelarutannya, akan tetapi lebih
baik untuk memilih suatu pelarut yang tidak tergantung pada kekuatan
elusi sehingga zat-zat elusi yang lebih kuat dapat dicoba. “kekuatan” dari
zat elusi adalah daya penyerapan pada penyerap dalam kolom.
Manfaat Dari Kromatografi Kolom
• Dalam bidang bioteknologi, kromatografi
mempunyai peranan yang sangat besar. Misalnya
dalam penentuan, baik kualitatif maupun
kuantitatif, senyawa dalam protein. Protein sering
dipilih karena ia sering menjadi obyek molekul yang
harus di-purified (dimurnikan) terutama untuk
keperluan dalam bio-farmasi. Kromatografi juga
bisa diaplikasikan dalam pemisahan molekul-
molekul penting seperti asam nukleat, karbohidrat,
lemak, vitamin dan molekul penting lainnya.
Dengan data-data yang didapatkan dengan
menggunakan kromatografi ini, selanjutnya sebuah
produk obat-obatan dapat ditingkatkan mutunya,
dapat dipakai sebagai data awal untuk
menghasilkan jenis obat baru, atau dapat pula
dipakai untuk mengontrol kondisi obat tersebut
sehingga bisa bertahan lama
• Dalam bidang clinical (klinik), teknik ini sangat
bermanfaat terutama dalam menginvestigasi fluida
badan seperti air liur. Dari air liur seorang pasien, dokter
dapat mengetahui jenis penyakit yang sedang diderita
pasien tersebut. Seorang perokok dapat diketahui apakah
dia termasuk perokok berat atau ringan hanya dengan
mengetahui konsentrasi CN- (sianida) dari sampel air
liurnya. Demikian halnya air kencing, darah dan fluida
badan lainnya bisa memberikan data yang akurat dan
cepat sehingga keberadaan suatu penyakit dalam tubuh
manusia dapat dideteksi secara dini dan cepat. Sekarang
ini, deteksi senyawa oksalat dalam air kencing menjadi
sangat penting terutama bagi pasien kidney stones (batu
ginjal). Banyak metode analisis seperti spektrofotometri,
manganometri, atau lainnya, akan tetapi semuanya
membutuhkan kerja ekstra dan waktu yang cukup lama
untuk mendapatkan hasil analisis dibandingkan dengan
teknik kromatografi
Kelebihan Dan Kelebihan Dari
Kromatografi Kolom
• 1.Kelebihan kromatografi kolom
• Dapat digunakan untuk analisis
dan aplikasi preparative.
Digunakan untuk menentukan
jumlah komponen campuran.
Digunakan untuk memisahkan
dan purifikasi substansi.
• 2.Kekurangan kromatografi
kolom
• Untuk mempersiapkan kolom
dibutuhkan kemampuan teknik
dan manual. Metode ini sangat
membutuhkan waktu yang lama
(time consuming).