Anda di halaman 1dari 30

YULIANA RETNOWATI,S.SI.,M.

SI
MATERI GENETIK
Kromosom
DNA plasmid
Ekstra kromosom mitokondria
genom kloroplas
Asam nukleat mRNA
RNA rRNA
tRNA

- DNA dalam sel terkemas dalam struktur kromosom (sel siap


membelah) atau benamg kromatin (sel dalam interfase)
- Langkah awal dari manipulasi genetik adalah mengeluarkan / isolasi
DNA dari sel melalui teknik pemecahan sel dan pemisahan DNA dari
komponen sel lainnya.
- Teknik pemecahan sel sangat tergantung dari jenis organismenya.
Promoter
regulatory sequences Aktivator
Operator
Gen
Exon
Unit transkripsi Intron
DNA genom sisi 5’ dan sisi 3’
Repeated sequences (urutan berulang)
non gen Junk DNA (DNA “sampah”)
Insetion sequences
Transposon

Definisi Gen : dulu : unit pembawa informasi yag dapat d


iturunkan (hereditas)
sekarang : segmen DNA atau RNA yang
mengandung unit informasi yang
dapat diturunkan
- DNA sebagai senyawa pembawa informasi genetik
memiliki struktur khas berupa jalin ganda yang
dihubungkan dengan ikatan hidrogen antara basa
nitrogen yang berpasangan
PLASMID

 Adalah DNA circular ektrakromosomal yang mampu


bereplikasi sendiri dalam kebanyakan sel bakteri, seperti E.
coli, mengandung gen untuk katabolisme dan aktivitas
metabollik, dan mengandung gen untuk resistensi terhadap
bakterophage, antibiotik dan beberapa logam berat.
 Pada plasmid mengandung 3 bagian utama, yaitu : replicator,
selectable marker dan a cloning site.
 Replicator (“ori”) : daerah/lokasi untuk memulai replikasi
dengan mekanisme replikasi yang sama dengan replikasi
kromosom dengan melibatkan DNA polimerase
 Marker : gen yang biasanya mengandunng resistensi terhadap
antibiotik
 The cloning site : sekuen pada nukleotid yang merupakan
posisi/sisi dimana terjadi pemutusan oleh endonuklease
restriksi.
 Ti plasmid pada Agrobacterium tumefaciens dapat digunakan
untuk integrasi DNA asing kedalam genom banyak tanaman
menghasilkan tanaman transgenik
Vectors
 Plasmids
 Viruses
 Particles ( DNA coated bullets)
 Exogenous DNA
Characteristics of a Vector
• Can replicate independently in the
host cell – contains an Ori
• Has restriction sites in the vector-
Polylinker cloning region
• Has a reporter gene that will
announce its presence in the host
cell
• Is a small size in comparison to the
host chromosome for easy of
isolation
Prinsip Dasar DNA Rekombinan
Rekayasa genetika :
:Teknologi untuk mencari gen-gen dan genom-genom dari
berbagai jenis organisme untuk dimanipulasi demi
kepentingan manusia.
: teknologi manipulasi materi genetik untuk menghasilkan
sifat baru suatu orgaisme
: usaha untuk memodifikasi (merubah) gen dan
memindahkan kembali ke organisme.
Recombinant DNA is a form of artificial
DNA, which is enginered through the
combination or insertion of one or
more DNA strands, thereby combining
DNA sequences which would not
normaly occur together.
Recombination

 Insert a foreign gene into a host


 Plasmid ( for example, exogenous DNA) into the
bacterial cell – transformation or transfection-
organism referred to as transgenic ( eukaryote ) or
recombinant( prokaryote)
 Goal – To produce many copies ( clones) of a particular
gene
 Penemu teknik DNA rekombianan adalah Stanley
Norman Cohen & Herbert Boyer tahun 1973 dan
dipublikasikan pada tahun 1974 dengan judul
“Contruction of Biologically Functional Bacterial
Plasmid in vitro”, yang menjelaskan tentang teknik
isolasi dan amplifikasi gen atau segmen DNA dan
insersi kedalam sel yang lain, menghasilkan
bakteri transgenik.
 Teknologi DNA rekombinan akan mungkin
dilakukan dengan adanya endonuklease restriksi
oleh Werner Arber, Daniel Nathans dan Hamilton
Smith tahun 1978.
Teknik penting dalam rekayasa genetika :
1. Isolasi gen
2. Rekombinasi DNA
3. Transfer gen
4. Ekspresi gen
Manfaat Rekayasa Genetik:
1. Meningkatkan pemahaman tentang biologi
molekuler
2. Meningkatkan pemahaman dan penanganan
terhadap penyakit
3. Menunjang perkembangan bioteknologi
bidanng industri, pertanian, dan obat-obatan
Aplikasi :
1. Bidang kedokteran
a. mengidentifikasi penyakit-penyakit:
- penyakit kelainan genetik
- penyakit kanker
- penyakit infeksi baik oleh bakteri,
virus maupun parasit lainnya
b. Memproduksi hormon, antibodi, obat-obatan dll melalui a.l
hewan transgenik, yakni hewan yang telah dimasuki gen dari luar.
2. Bidang pertanian
penerapan kloning gen pada tanaman sering menggunakan bakteri
khusus yaitu Agrobacterium tumefaciens.
- menghasilkan tanaman transgenik yang tahan terhadap serangan
hama
- menghasilkan tanaman transgenik yang mempunyai kualitas
unggul
- englangkan sifat-sifat kurang menguntungkan dari tanaman
ENZIM RESTRIKSI

- Enzim restriksi mengkatalisis pemotongan DNA pada daerah tertentu


yang mempunyai urutan nukleotida yang spesifik.
- Nuklease mendegradasi molekul DNA dengan memecah ikatan
fosfodiester yang menghubungkan satu nukleotida dengan nukleotida
berikutnya pada untai DNA.
- Ada 2 macam nuklease yaitu :
a. eksonuklease, yang menghilangkan nukleotid satu per satu dari
ujung molekul DNA
b. endonuklease, yang memecah ikatan fosfodiester internal pada
molekul DNA
- Restriksi dihasilkan oleh bakteri untuk meghancurkan DNA fag
sebelum fag ini bereplikasi dan mengambil alih sistem metabolisme sel
inang.
Tools for Recombination
 Restriction enzymes
KLONING GEN

- Klon adalah suatu populasi organisme, sel, virus atau molekul DNA yang
secara genetik identik.
- Proses utama dalam pembuatan rekombinan DNA yang meliputi teknik
memperbanyak potongan DNA atau gen dengan mengunakan organisme
tertentu (Gambar ).
- Kloning gen/DNA dapat dilakukan dengan membuat rekombinan DNA dan
diperbanyak secara invivo, atau amplifikasi DNA secara invitro dengan metode
PCR (polymerase chains reaction)
- Teknik penting dalam kloning gen (invivo) :
kromosomal
Prokariotik
1. a) Isolasi DNA plasmid kromosomal
uniselular
Eukariotik (khamir) plasmid
kromosomal
multiselular mitokondria
kloroplas
b) Isolasi mRNA untuk pembuatan cDNA
Proses utama dalam isolasi DNA genom adalah :
a. Memecah sel-sel sehingga isi sl tersebut, termasuk DNA
genom keluar.
b. Memisahkan materi DNA genom dari senyawa lain,
misalnya protein, lemak, karbohidrat dll melalui setrifugasi
c. Melarutkan kembali DNA genom yang diperoleh sebagai
bahan untuk isolasi gen atau potongan DNA tertentu

2 . Pemotongan DNA (insert dan vektor) dengan


endonuklease restriksi
• Enzim retriksi memotong DNA pada daerah tertentu dan dapat
disambung kembali dengan potongan DNA lain yang mempunyai
ujung komplemennya oleh enzim ligase
• Pemotongan DNA dengan endonuklease restriksi akan
menghasilkan ujung yang berupa sticky ends (runcing) atau blunt
ends (tumpul) tergantung dari jenis enzimnya.
• Ujung yang runcing mudah disambung kembali oleh enzim ligase
sedang ujung DNA yang tumpul dapat ditambahkan dengan
terminal deoksinukleotidil transferase (penambahan oligo A dan
oligo T ujung 5’ dan 3’).
3. Penyambungan potongan DNA
dengan vektor (plasmid, DNA
bacteriophage)
4. Pemindahan rekombinan DNA ke
sel melalui trasnformasi/transduksi
5. Seleksi transforman melalui uji
resistensi terhadap antibiotik
6. Amplifikasi rekombinan melalui
proses pertumbuhan sel transforman
7. Uji untuk ekspresi gen
Recombinant DNA
TEKNIK POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

- Teknik PCR merupakan satu metode amplifikasi (penggandaan)


fragmen (potongan) DNA secara invitro.
- Teknik ini memerlukan adanya campuran reaksi (reaction mixture)
dari senyawa-senyawa yang digunakan untuk sintesis DNA :
1. DNA template, merupakan DNA yang akan diamplifikasi
2. Primer forward dan reverse (berupa oligonukleotida yang menempel
pada ujung fragmen DNA (ujung 5’ dan 3’) yang akan diamplifikasi
3. enzim taq polimerase (enzim polimerase yang mampu bekerja pada
suhu tinggi)
4. substrat dNTP (terdiri dari 4 macam nukleotida : dATP, dCTP, dGTP
dan dTTP)
5. Ion Mg2+ dalam bentuk MgCl2
6. Buffer (larutan penyangga) terdiri dari 100mMTris-HCL (pH 8,3),
500 mM KCl, dan 0,1% gelatin
7. deionized H2O untuk membuat volume akhir menjadi 25 atau 50 µl
8. mineral oil (untuk mencegah penguapan) ditambah sesuai dengan
volume campuran reaksi.
- Teknik PCR memerlukan peralatan thermocycler
yakni peralatan yang dapat diatur temperatur dan
waktu secara cepat dn berulang.
- Untuk menjalankan thermocycler dengan cara
membuat program :
1. suhu dan waktu denaturasi (pemutusan ikatan
hidrogen antara jalin ganda DNA) antara 93 – 1000C
selama 5 – 10 menit
2. Suhu dan waktu anneling (menempelnya primer
pada urutan DNA yang kompatibel) antara 37 – 650C
selama 1 – 2 menit
3. Suhu dan waktu pemanjangan rantai DNA
(extention) pada suhu 720C selama 1 – 2 menit
4. Jumlah siklus (putaran untuk mensintesis DNA
fragmen baru lagi) antara 20 – 35 siklus.
© 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter.
EKSPRESI GEN

GEN :
- Gen merupakan segmen DNA yang mampu diekspresikan sebagai
fenotip suatu organisme melalui serangkaian mekanisme yang
melibatkan transkripsi dan translasi

regulatory sequences
Sense strand 5’
3’
5’
tempalte strand 3’ exon1 intron1 exon2 intron2 exon3

transcription unit

gene

Gambar : The DNA segment that constitute a gene


- Urutan (sekuen) DNA suatu gen tidak semua ditrankripsi menjadi RNA
atau ditranslasi menjadi protein fungsional, namun keseluruhan sekuen
DNA tersebut berperan penting dalam ekspresi gen.
- Sekuen pengatur dari suatu gen menentukan apakah gen tersebut
diekspresikan secara aktif atau tidak, dan daerah sekuan tersebut dapat
digantikan dengan sekuen pengatur dari gen lain (misal sekuen
promoter)
- Struktur gen pada organisme prokariotik dan eukariotik memiliki
perbedaan, terutama pada daerah regulatory sequence dan unit
transkripsi.
- Perbedaan struktur tersebut berpengaruh dalam proses ekpresi gen,
terutama transkripsi untuk mRNA
- Pada eukariotik, tidak semua unit transkripsi untuk mengkode asam
amino (intron), hanya bagian exon yang akan diproses lebih lanjut untuk
translasi.
© 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and
Peter Walter.
EKSPRESI GEN

- Ekspresi gen pada prokaryotik maupun eukaryotik selalu


dimulai dengan proses trankripsi

Figure 6-7. DNA transcription


produces a single-stranded
RNA molecule that is
complementary to one strand
of DNA.

© 2002 by Bruce Alberts, Alexander


Johnson, Julian Lewis, Martin Raff,
Keith Roberts, and Peter Walter.
- Prokaryotik dapat melakukan transkripsi yang selanjutnya
diikuti dengan proses translasi tanpa pemrosesan untuk mRNA
- Proses transkripsi diawali dengan perjalanan RNA polimerase
sepanjang rangkaian DNA hingga menemukan daerah promoter
- Pengenalan daerah promoter oleh RNA polimerase
menyebabkan enzim tersebut memperkuat asosiasinya, dan
terjadi pembukaan jalin ganda dan dimulainya inisiasi
transkripsi pada daerah +1
- Prokaryotik hanya memiliki satu macam RNA polimerase,
sedang eukaryotik memiliki 3 macam RNA polimerase : pol I, II
dan III (pol A,B,C), sehingga gen yang ditranskrip menggunakan
ketiga macam RNA polimerase tersebut disebut sebagai gen klas
I, II dan III.
RNA Polimerase
- E.coli hanya memiliki satu macam RNA
polimerase untuk semua proses sintesis RNA.
- RNA Polimerase tidak memiliki kemampuan
“proff reading” (pembacaan ulang), sehingga
kesalahan selama transkripsi adalah setiap 104 –
105 ribonukleotida
- Dari satu gen umumnya dihasilkan banyak
kopi RNA dan selanjutnya RNA tersebut akan
didegradasi.
© 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts,
and Peter Walter.
 SINTESIS PROTEIN DAPAT DIBAGI MENJADI 5
TAHAPAN :
- Aktivasi asam amino, pengikatan asam amino
pada tRNA yang sesuai yang dikatalisis oleh
aminoasil-tRNA sintetase. Proses ini berlangsung
di sitosol.
- Inisiasi, pembentukan ikatan antara mRNA kodon
pertama (AUG) pada subunit kecil ribosom
- Pemanjangan, penambahan asam amino secara
berturut-turut (sesuai dengan kodon pada mRNA)
melalui ikatan peptida.
- Terminasi, pelepasan rantai polipeptida dari
ribosom
- Pemrosesan dan pembentukan konformasi tiga
dimensi dari polipeptida yang terbentuk
Figure 29.20. Initiation
Sites. Sequences of
mRNA initiation sites for
protein synthesis in
some bacterial and viral
mRNA molecules.
Comparison of these
sequences reveals some
recurring features

© 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts,
and Peter Walter.