PRAKTIKUM ANALISIS INSTRUMENTAL

KELOMPOK 4 KELAS 1E D3 TEKNIK KIMIA

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY
 HPLC

Teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. Prinsip dari HPLC sendiri yaitu
memisahkan analit-analit berdasarkan kepolaranya.

HPLC Slide 3
 Apa yang membedakan HPLC dengan metode yang lain?

HPLC menggunakanzat cair sebagai fase geraknya. Sampel yang telah dilarutkan dapat dipisahkan dan dihitung konsentrasinya zat spesifik yang
terkandung didalamnya, contohnya kandungan kafein dapat diukur dalam HPLC berdasarkan afinitas kafein terhadap fase diam pada kolom yang
digunakan.

HPLC Slide 4
 KEGUNAAN HPLC
Dapat memisahkan zat-zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedkit polar sampai polar, asam-asam
nukleat, morfin, heroin dan semacamnya, vitamin-vitamin yang larut dalam air, dapat digunakan untuk
menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia. Dapat digunakan untuk memurnikan dan
mengidentifikasi suatu senyawa.

HPLC Slide 5
 Prinsip Kerja HPLC

Prinsip HPLC menggunakan prinsip kromatografi untuk mengukur sampel. Dalam kromatografi, analisis ini
dilakukan dengan cara memisahkan molekul berdasarkan perbedaan struktur ataupun komposisinya. Pemisahan
tersebut terjadi saat sampel bergerak melewati fase diam karena terbawa oleh fase gerak

HPLC Slide 6
HPLC Slide 7
 Instrumentasi HPLC

1. Fase Gerak dan Reservoir Pelarut

2. Pompa
3. Injektor
4. Sampel
5. Kolom HPLC
6. Detektor
7. Pengolah Data

HPLC Slide 8
 Fase Gerak dan Reservoir Pelarut

Fase gerak pada HPLC harus menggunakan pelarut dengan kemurnian sangat tinggi. Idealnya, pelarut
khusus yang memang sudah memenuhi standard untuk HPLC dipergunakan untuk hasil yang lebih
akurat. Reservoir pelarut merupakan wadah penyimpanan fase gerak, biasanya berbentuk botol kaca
dengan selang penghubung.

Kiri: Methanol khusus HPLC ; Kanan: Reservoir yang terhubung ke pompa

HPLC Slide 9
Wadah Fase Gerak

BERSIH

LEMBAM GELAS
( INERT)

Menampung 1-2 L
FASE GERAK

Polar dan/atau Non Polar Disaring Terlebih Dahulu

PELARUT KOTORAN
UDARA/GAS NEXT

HPLC Slide 10
 Pompa

Seperti yang sudah disebutkan sebelumnya, pompa yang

digunakan dalam HPLC haruslah pompa bertekanan tinggi agar
dapat mendorong fase gerak dalam reservoir menuju kolom fase
diam dan melewati detektor. Tekanan yang digunakan beragam
tergantung dari dimensi kolom, ukuran partikel fase diam, serta
laju alir dan komposisi dari fase gerak yang akan dipakai.

HPLC Slide 11
 Inert Terhadap Fase Gerak(
kaca, baja anti karat,
teflon )

Mengalirkan fase gerak Memberikan Tekanan 5.000

dengan kecepatan alir PSi
3 mL/menit

HPLC Slide 12
 Injektor

Injektor merupakan tempat masuknya sampel ke

dalam sistem HPLC. Proses injeksi dapat dilakukan
secara manual dengan syringe atau dengan
menggunakan sistem injeksi otomatis. Injektor pada
HPLC harus dapat menampung sampel cairan dalam
kisaran volume 0.1-100 mL.

HPLC Slide 13
 Sampel

Sampel yang dapat dianalisis menggunakan HPLC

harus bersifat bening dan tidak ada endapan, untuk itu
preparasi sampel diperlukan sebelum dianalisis,
misalnya dengan melakukan filtrasi sampel. Preparasi
lain dapat pula dilakukan sesuai kebutuhan seperti
mengatur konsentrasi sampel, desalting, dan lain-lain.

Botol sampel

HPLC Slide 14
 Kolom HPLC

Aktivitas utama dalam HPLC terjadi di dalam kolom sebagai

fase diam. Di dalam kolom akan terjadi pemisahan komponen
sampel yang kemudian dapat dihitung waktu retensi masing-
masing komponennya oleh detektor. Waktu retensi adalah
waktu yang dibutuhkan oleh senyawa komponen sampel untuk
melewati kolom menuju detektor. Waktu retensi dihitung dari
saat sampel diinjeksikan hingga puncak pembacaan maksimum
pada detektor. Senyawa yang berbeda akan memiliki waktu
yang berbeda sehingga masing-masing konsentrasinya dapat
dihitung.
Kolom HPLC tersedia dalam panjang serta packing
material yang berbeda-beda tergantung dari jenis HPLC yang
hendak digunakan. Packing material merupakan material yang
diisikan ke dalam kolom sebagai fase diam. Packing
material yang sering digunakan biasanya yang berbasis silika,
baik silika yang tidak dimodifikasi maupun yang telah
termodifikasi seperti oktadesil silika (ODS) yang memiliki
lapisan C18.

Kolom Silika dari Thermo Scientific

HPLC Slide 15
 Detektor

Alat ini berfungsi untuk mendeteksi keberadaan

komponen yang telah melewati kolom dan memberikan
sinyal elektronik pada pengolah data. Terdapat
beberapa jenis detektor HPLC tergantung dari
karakteristik yang hendak dibaca. Misalnya pada
detektor jenis UV-vis, maka karakteristik yang dibaca
oleh detektor adalah absorbansinya. Detektor jenis lain
yang bisa digunakan adalah detektor indeks bias,
fluoresensi, serta detektor elektrokimia.

Detektor UV-Vis

HPLC Slide 16
 Detektor
dikelompokkan menjadi 2

detektor universal Detektor spesifik

Detektor UV-Vis, Detektor Fluoresensi dan Detektor

Detektor Indeks Bias dan Detektor Spektrometri Massa Elektrokimia
mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan
spesifik, dan tidak bersifat selektif selektif

HPLC Slide 17
 Karakteristik Detektor Ideal

4. mempunyai sel volume yang kecil

1. mempunyai respon terhadap solut sehingga mampu meminimalkan
yang cepat dan reprodusibel pelebaran pita

5. signal yang dihasilkan berbanding

2. mempunyai sensitifitas yang tinggi, lurus dengan konsentrasi solut pada
yakni mampu mendeteksi solut pada kisaran yang luas (kisaran dinamis
kadar yang sangat kecil linier)

6. tidak peka terhadap perubahan

3. stabil dalam pengoperasiannya suhu dan kecepatan alir fase gerak

HPLC Slide 18
 Pengolah Data

Pengolah data menampilkan output visual hasil

analisis yang terbaca oleh detektor dalam bentuk
kromatogram. Kromatogram menggambarkan jumlah
komponen pada sampel dilihat dari jumlah puncak
(peak) yang dihasilkan. Konsentrasi komponen yang
hendak dianalisis dapat dihitung dengan
membandingkan luas area peak komponen dengan
luas area peak serta konsentrasi standar.

Contoh kromatogram

HPLC Slide 19
 Kelebihan Dan Kekurangan HPLC

Kelebihan Kelemahan
1. Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran 1. Harga sebuah alat HPLC cukup mahal
dengan daya memisah yang tinggi
2. Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor
2. Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan
3. Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan
analisis
ukuran 3 dan 5 mikrometer sela-sela partikel lebih mudah
3. Dapat digunakan bermacam-macam detektor dengan kepekaan tertutup oleh kotoran, jadi harus seringkali dicuci dan kemurnian
yang tinggi larutan harus dijaga
4. Kolom dapat digunakan kembali
5. Waktu analisa cukup singkat
6. HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah
menguap dan zat yang tidak stabil
7. Dapat menganalisa sampel yang kecil kuantitasnya
8. Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar

HPLC Slide 20