REACCIÓN EN

CADENA DE LA
POLIMERASA(PCR)

INTEGRANTES:
Naysha Nina Dilas
Alexandra Mamani Chávez
Cristhyan Mita Chara
Anderson Flores Yufra
 ¿QUÉ ES LA PCR?
Es una técnica de biología molecular desarrollada en
1986 por Kary Mullis

El objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de

ADN particular, partiendo de un mínimo.

Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es

que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una
muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad,
identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el
ADN amplificado.
 COMPONENTES DE LA PCR
Equipos
 Termociclador:el aparato
que va a mantener la
temperatura necesaria en
cada una de las etapas
que conforman un ciclo.
 Vortex
 Micropipetas
 Microcentrífuga
Reactivos
 ADN que contenga la región(es)
que se desea amplificar
 Buffer o solución amortiguadora :
mantiene el pH adecuado para el
funcionamiento de el ADN
polimerasa.
 Cloruro de Magnesio (MgCl2): lo
necesita la Taq para actuar, es un
cofactor.
 Desoxirribonucleótidos trifosfato
(dNTPs):son los nucleótidos
necesarios para formar o producir
las copias de ADN durante los
diferentes ciclos de la PCR.
 Iniciadores: son moléculas de ADN
de pequeño tamaño,cada uno son
complementarios a una de las dos
hebras del ADN, son secuencias
cortas, de entre seis y cuarenta
nucleótidos, permiten que la
polimerasa inicie la reacción .
 ADN polimerasa o mezcla de
distintas polimerasas con
temperatura óptima alrededor de
70 °C (la más común es la
polimerasa Taq)
 Agua destilada
 Iones monovalentes, como el
potasio.
2018].
 ETAPAS DE LA PCR
DESNATURALIZACIÓN: en esta etapa
las cadenas de ADN son calentadas a
95 C° durante un tiempo promedio de
20 a 30 segundos, con el objetivo de
separar ambas cadenas. Si la cadena
de ADN contiene gran cantidad de
uniones g-c será necesario mayor
tiempo, ya que la unión de éstas se
hace mediante tres enlaces, uno más
que las bases a-t. Al final de esta etapa
tendremos las cadenas separadas, las
cuales servirán como molde.
HIBRIDACIÓN: en esta etapa participan los
primers, los cuales son secuencias de
oligonucleótidos que delimitan la secuencia
blanco que se quiere amplificar. En la etapa de
hibridación los primers se alínean al extremo 3’
de la cadena molde, para lo cual se necesitan
dos secuencias diferentes, una denominada
forward, o sentido, y otra reverse, o antisentido.
Para que esto suceda es necesario que el
termociclador alcance una temperatura entre 50-
60 C°, generalmente se necesitan 30 segundos
en este ciclo.
EXTENSIÓN: en esta etapa se necesita una
enzima con la función de ADN polimerasa, la
cual se encargará de la catálisis de la
reacción, sintetizando nuevas cadenas de
ADN a partir de una cadena molde. La
enzima más usada es la Taq ADN polimerasa,
con capacidad de soportar temperaturas muy
altas. Proviene de una bacteria termófila
llamada Thermophilus aquaticus. En la etapa
de extensión la Taq polimerasa actúa sobre el
complejo templado-primers a una
temperatura óptima de 72 C°, y a una
velocidad muy rápida agrega los
desoxirribonucleótidos libres (dntp’s)
complementarios, creando así las cadenas
completas de ADN.
Los dntp’s son las bases nitrogenadas que
normalmente se utilizan a una
concentración entre 0.2 a 1.0 mM, para
obtener un producto de amplificación de 1
000 pb se requiere de un minuto.
Al final de cada ciclo se habrán duplicado
dos cadenas de ADN a partir de una, y de
esta forma la replicación de una cadena
blanco por cada ciclo se realiza de manera
exponencial y logarítmica.
ELONGACIÓN FINAL: Se lleva
a cabo a una temperatura de
70-74 °C durante 5-15 minutos
tras el último ciclo de PCR. Con
ella se asegura que cualquier
ADN de cadena simple restante
sea totalmente ampliado.

CONSERVACIÓN: Este paso

que se lleva a cabo a 4-15 °C
durante un tiempo indefinido
para conservar la reacción a
corto plazo.
NÚMERO DE CICLOS
Este número de ciclos depende de la
cantidad de ADN que existe en la muestra
una vez que el resto de factores han sido
optimizados (normalmente de manera
empírica).
Hay que tener en cuenta que la reacción está
producida por una enzima que sufre el efecto
meseta que describe la atenuación en la tasa
de la acumulación del producto. Después de
un número determinado de ciclos la
amplificación deja producirse de manera
exponencial y llega a una fase estacionaria.
Generalmente cuando el efecto meseta se
produce, la cantidad de ADN sintetizado es
suficiente para su posterior utilización.
CONTAMINACIÓN EN LA PCR

La Reacción en Cadena de la Polimerasa es una técnica muy sensible, por lo que es

de gran importancia evitar contaminaciones, ya que es posible que el ADN no deseado
(aunque se encuentre en una cantidad muy pequeña) se amplifique y obtengamos un
resultado que no es real. Vemos que una de sus mayores ventajas de la técnica, se
convierte a la vez en el principal inconveniente .
Existen una serie de normas que ayudan a evitar las contaminaciones. En el caso de
trabajar con muestras de ARN las precauciones se deben extremar al máximo:

Realización de
Uso de controles de
Lugar físico
instrumental
Utilización de Uso de guantes blanco (se añade
exclusivo para reactivos y por el agua en lugar de
exclusivo para
realizar la PCR tubos estériles manipulador ADN, no debe
la PCR existir
amplificación).
 TIPOS DE PCR
PCR IN SITU: La PCR in situ consiste en una
PCR EN TIEMPO REAL O PCR
reacción de PCR en secciones histológicas o
CUANTITATIVA (QPCR): Reacción
células, donde los productos generados pueden
de PCR cuya principal característica
visualizarse en el sitio de amplificación. En la
es que permite cuantificar la cantidad
técnica de PCR in situ se realiza una primera
de ADN o ARN presentes en la
amplificación de ADN blanco y luego detección
muestra original, o para identificar con
mediante hibridación in situ convencional con
una muy alta probabilidad, muestras
sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden
de ADN específicas a partir de su
detectarse cantidades pequeñísimas de genoma.
temperatura de fusión .Se puede
Esta tecnología es de gran alcance en la capacidad
dividir en las técnicas basadas en
de amplificar específicamente una población de
fluorocromos no específicos
secuencias de menor representación.

PCR MÚLTIPLE: PCR en la cual se amplifica
simultáneamente más de una secuencia.
Para ello, se combinan dos o más pares de
cebadores en un mismo tubo, junto con el
resto de los reactivos de la reacción en
cantidades suficientes, para amplificar
simultáneamente varios segmentos de
ADN. Ventajas: información sobre varios
locus en una sola reacción, menor cantidad
de molde para el análisis, menor cantidad de
reactivos, rápida construcción de bases de
datos. Desventajas: para llevarla a cabo
adecuadamente y sin errores, se requiere de
una cuidadosa optimización del proceso.
PCR ANIDADA: Técnica muy sensible de PCR
en la que el producto de una amplificación es
utilizado como molde para realizar una segunda
amplificación con cebadores que se ubican
dentro de la primera secuencia amplificada, es
decir, cuando tenemos el primer amplicón se
pueden unir los cebadores y se hace de nuevo
una amplificación dentro del amplicón inicial.
Este tipo de PCR tiene la ventaja de brindar alta
sensibilidad y especificidad. La especificidad
aumenta porque como es amplificación de un
amplicón obtenido previamente, los cebadores
sólo van a hibridar en un sitio dentro de la
molécula y el resultado será una única banda.
Así, evitamos posibles hibridaciones
inespecíficas de los cebadores. La
desventaja de esta técnica es que no nos
permite cuantificar la muestra.