BIOANALISIS

Dra.Aniek Setiya Budiatin MSi

Dra.Toetik Aryani MSi

Bagian Farmasi Klinik

Fakultas Farmasi Universitas Airlangga
 Pengertian
Bioanalisis:
Analisis senyawa tertentu baik endogen maupun
eksogen termasuk obat secara kualitatif dan atau
kuantitatif dalam sampel biologis dengan metode yang
sahih

Analytical methods validation

Bioanalytical methods validation

Good Laboratory Practice

 Ruang Lingkup
Kimia
Tahap reaksi Invitro
Farmasi Pencemaran lingkungan Kedokteran
Bioekivalensi Pemeriksaan residu Pemeriksaan DNA
Terapi drug monitoring Biomarker penyakit
Pengembangan obat baru Perkiraan usia

Bioanalisis
Forensik
Penyalahgunaan obat Biokimia
Overdosis Proses metabolisme
Pemeriksaan DNA Perubahan biokimiawi
Biologi/mikrobiologi Penetapan protein marker
Uji potensi / aktivitas
Proses fisiologis/biologis
 Pentingnya Bioanalisis
1. Sampel biologik sangat kompleks
a. Konsistensi
Liquid Solid
CSF Otak
Air mata Jantung
Keringat Ginjal
Air liur Hati
Empedu Paru-paru
Cairan sendi Otot
Cairan lambung Tulang
Urin Rambut
Mixed
Kuku
Plasma
Serum
Darah
Feces
b. Komposisi
- Komponen :
- Air
- Protein
- Lipid
- Senyawa endogen
- Sangat mempengaruhi stabilitas
- Adanya enzim
- PH
- Komponen yang peka terhadap oksidasi
- Komponen dari sel yang mengalami lisis
2. Sifat obat dalam sampel biologik
- Unchanged / parent drug
- Metabolit
- Konjugasi metabolit

3. Permasalahan dalam preparasi sampel

- Bagaimana mengisolasi analit dari matrik biologik ?
- Pertimbangan proses ekstraksi yang tidak sederhana
a. Pemilihan metode ekstraksi
b. Pemilihan solven
c. Pemilihan senyawa kimia / reagen yang terlibat
(interaksi, interferensi)
Ekstraksi
Urine Ro 31-1411
b-blocker
pH 10
Aqueous Organic

Acidic and Amphoteric Neutral and Basic

pH 3 pH 3
Aqueous Organic Aqueous Organic

Amphoteric Acidic Basic Neutral

Manfaat Bioanalisis di Bidang Farmasi

1. Uji bioavailabilitas / bioekivalensi

suatu sediaan farmasi
2. Farmakokinetika klinik
3. Pemeriksaan penyalahgunaan obat
4. Pengembangan obat baru
5. Riset tentang obat
1. Bioavailabilitas / bioekivalensi suatu sediaan
farmasi
Bioavailabilitas: Persentase dan kecepatan zat aktif dalam
suatu produk obat yang mencapai atau tersedia dalam
sirkulasi sistemik dalam bentuk utuh atau aktif setelah
pemberian produk obat, diukur kadarnya dalam darah
atau dari ekskresinya dalam urin (Badan POM, 2005)
Jika produk obat mempunyai ekivalensi farmasetik atau
alternatif farmasetik dan pada pemberian dengan
dosis molar yang sama akan menghasilkan
bioavailabilitas yang sebanding sehingga efeknya
sama (efikasi dan keamanan)

Bioekivalen
Untuk itu diperlukan adanya penetapan kadar obat dalam
darah atau cairan tubuh yang lain

Analisis matematik (Cp vs t)

t 1/2, ka, ke, AUC

Kecepatan dan tingkat absorpsi

Sifat fisikokimia obat
Faktor formulasi

Kurva Cp vs t untuk sediaan oral Penting untuk seleksi

penggantian obat oleh farmasis
2. Farmakokinetika klinik
Menetapkan kadar obat dalam darah atau cairan biologis
lainnya penderita

Monitoring penggunaan obat (TDM)

Regimen dosis secara individual dan rasional

Syarat: Contoh:
- Rentang terapi sempit - Digoksin dan teofilin (rasio 2)
- Rasio dosis toksik/terapi <10 - Gentamisin (nefrotoksik)
- Fenitoin
- Litium sitrat
- Pimozid
- Klozazepin
3. Pemeriksaan penyalahgunaan obat atau doping
Pemeriksaan obat atau hormon tertentu dalam darah atau
urin pada orang yang dicurigai menggunakan obat-obat
tertentu
Contoh:
Penyalahgunaan obat Doping
Heroin Anabolik steroid
Morfin Efedrin
Metamfetamin Tetrahidrogestrinon
Cocain Modafinil
Golongan barbiturat
Golongan benzodiazepin
4. Pengembangan obat baru
Penelitian untuk medapatkan senyawa obat yang lebih baik
secara kimiawi, biokimiawi, farmakologi dan toksikologi

Tujuan:
- Memperbaiki bioavailabilitas dan disposisi
- Memperbaiki absorpsi untuk obat-obat yang
mempunyai nilai F kecil (sedikit diabsorpsi bila
diberikan secara per oral)
- Mendapatkan rute pemakaian yang sesuai
- Memperpanjang t1/2 obat
 5. Riset tentang obat
Meliputi:
1. Mempelajari mekanisme interaksi obat dengan reseptornya
2. Kuantifikasi ikatan obat dengan reseptor
3. Hantaran signal setelah obat berikatan dengan reseptornya
4. Metabolisme obat dalam tubuh
5. Mekanisme ekskresi obat dari tubuh
 Literature
1. Smith RV, Steward JT (1981)
Textbook of Biopharmaceutics Analysis: A description of
methods for the determination of drugs in biologic fluids
2. Chamberlain J (1995)
Analysis of Drugs in Biological Fluids: Second edition
3. Venn RF (2000)
Principles and Practice of Bioanalysis
4. Evans G (2004)
A Handbook of Bioanalysis and Drug metabolism
 Kelengkapan Analisis
1. Prosedur
Tahapan pelaksanaan secara tertulis yang menyangkut
pelaksanaan metode analisis pada garis besarnya saja

2. Protokol
Uraian yang spesifik dan terinci untuk tahapan
pelaksanaan metode analisis
 Validasi Metode Analisis
1. Linearity (Rentang kelurusan)
-Hubungan linear antara konsentrasi dan respon

Kurva baku
- Linear kadar kecil dan besar
- Pada spektrofotometri : Serapan VS kadar
Kromatografi : Area kromatogram vs kadar
Fluorensensi : Intensitas fluoresen vs kadar
2. Sensitivity (Sensitifitas)
- Batas kadar terkecil yang dapat ditentukan
- LOD (limit of detection) Tanpa pembanding
- LOQ (limit of quantification) Pembanding
3. Precision (Presisi)
-Penyimpangan pengukuran dengan metode analisis tertentu

Replikasi

Simpangan baku (SD) ---- CV (20%)

-Kadar << ---- SD >
4. Accuracy / kecermatan
Keterdekatan hasil analisis yang diperoleh melalui
suatu netode tertentu dengan harga sebenarnya

Dinyatakan sebagai % recovery 80 - 120 %

5. Repeatibility/ Keterulangan/ Replikasi
-Diulang terhadap sampel dengan prosedur yang sama
-Dalam Laboratorium dengan operator sama

6. Reproducibility
- Metode sama
- Laboratorium dengan operator beda atau berbeda
laboratorium

7. Sahih / mantap
- Dibanding dengan metode lain hasilnya sama
Hubungan validasi metode dengan tujuan analisis

Tujuan Spesifitas Sensitifitas Presisi Akurasi Kecepatan

Forensik L L L L M
Overdosis M L L L H
TDM M M L L H
Farmakologi H M M M L
Toksikologi L M L L M
Metabolisme H M M M L
Farmakokin H H H H M
Formulasi M H M M H
Compliance L M L L M
Farmakodin H H H H M
Keterangan: L = low, M = medium, H = high
Tipe dan Tingkat Validasi Metode Analisis
1. Full validation
- Obat sama sekali baru ( investigational new drug application)
- Obat baru (New drug application)
- Jika bercampur dengan metabolit

2. Partial validation
- Adanya perubahan analis atau laboratoris
- Perubahan metode analisis (sistem deteksi)
- Perubahan antikoagulan yang digunakan
- Perubahan matriks (darah ke urin)
- Perubahan proses pengumpulan sampel
- Perubahan rentang konsentrasi
- Perubahan instrumen dan atau software
- Keterbatasan volume sampel
3. Cross validation
- Perbandingan parameter validasi dengan dua atau lebih
metode bioanalitikal yang digunakan untuk
menghasilkan data pada studi yang sama
- Contoh: LC-MS-MS dengan ELISA
 Penanganan Sampel Biologis
1. Plasma dan Serum
-Banyak mengandung protein
-Protein perlu didenaturasi diendapkan
1. Dipanaskan pada suhu 90oC selama 5-15 menit
-Tidak efisien
-Analit mengalami kerusakan
2. Saturasi dengan amonium sulfat
-Cukup efisien
-Supernatan (gr) meningkat
-pH akhir 7
3. ZnSO4 / NaOH
-Efisien
-Endapan halus
-pH akhir 7.0
-Dapat dilakukan pada temperatur kamar
4. Asam perklorat
-Efisien
-Temperatur dingin --- explosion
-pH akhir < 7.0
-Analit dapat terektraksi dengan baik
5. Tricloro asetat
-Sangat efisien
-Reagen harus dingin
-Reagen sukar dipisahkan dari analit
- Afinitas obat-protein kuat
-Ultrafiltrasi
Free drug
-Dialisis

- Analisis mikrobiologi Free drug

- Jika dipakai serum/plasma segera sentrifuge “whole
blood” 2000g selama 5-10 menit
- Antikoagulan biasa dipakai asam sitrat, EDTA atau
heparin
- Jika tidak langsung dianalisis sampel harus dibekukan
-15oC s/d -80oC
- Untuk senyawa ester + esterase inhibitor NaF
- Untuk senyawa tertentu (morfin) jika disimpan lebih dari
1 bulan harus ditambahkan antioksidan (misal vitamin C)
- Hindari komtaminasi ditempatkan pada tabung yang
bersih
2. Urin
- Umumnya bebas protein dan lemak
- Dapat langsung diekstraksi dengan pelarut organik
- Harus diperhatikan pH
pH urine normal : 5.5 -7.0
Tergantung :Diet
Pengobatan dengan antasida

pH meningkat

Sangat mempengaruhi kelarutan obat

Contoh: amfetamin (sifat basa lemah)
banyak diekstraksi pada pH asam
-Urin jika dibiarkan lama akan melepas CO2

Makin bersifat alkali

Fosfat anorganik akan mengendap

-Untuk sampel urin biasa ditambah pengawet misal

toluena
 3. Padat (otak, jantung, hati, otot, rambut)
Sampel padat
Simpan pada suhu -20oC atau -80oC
Teflon paddle homogenizer
Homogenizer Automatic homogenizer
Leupeptin Tissue cutter homogenizer
Aprotinin
Sentrifuge
1000xg, 10 min 100.000xg, 30 min

Whole cell Fraksi sitosol Fraksi membran

Endogenous Protein / peptida Reseptor
Exogenous Endogenous Protein terikat membran
Protein yang terdistribusi Exogenous (obat)
dalam sitosol dan Sitokrom
membran Enzim
 Metode Analisis
1. Kimiawi
Spektrofotometri
Spektrofluorometri
Kromatografi (Cair, Gas, KCKT/HPLC, UPLC)
Spektrometri masa
Perkembangan: LC-MS; LC-MS-MS)
2. Biologi/mikrobiologi
Eastern dan Western Blotting
(RT-PCR) Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction
Receptor Binding Assay
Uji potensi atau aktivitas
3. Imunologi
Elisa (Enziyme linked Immunosorbent Assay)
RIA (Radio Immuno Assay)
FPIA (Fluorescence Polarization Immuno Assay)
IMMULITE (Chemiluminecent Immuno Assay )