Isolasi dan Pemurnian Enzim Lipase

KELOMPOK III:

MUSNIATI AZIS H012191011

BAHRUN H012191021

Sekolah Pasca Sarjana-Program Studi Kimia

Universitas Hasanuddin
Makassar
2019
1. ENZIM

2. ENZIM LIPASE

3. ISOLASI ENZIM LIPASE

4. APLIKASI ENZIM LIPASE

1. ENZIM
A. Pengertian Enzim
Enzim berasal dari kata in + zyme yang berarti sesuatu di dalam ragi. Enzim
merupakan senyawa protein yang berfungsi sebagai katalisator pada reaksi-reaksi
kimia dalam sistem biologis.
Berdasarkan tempat bekerjanya, enzim dapat dibedakan dalam dua golongan, yaitu
1. endoenzim
2. eksoenzim
Berdasarkan biosintesisnya, enzim dibedakan menjadi
1. enzim konstitutif
2. enzim induktif.
B. Mekanisme Kerja Enzim

(a) Mekanisme Reaksi, (b) Mekanisme Kerja Enzim

C. Hipotesis Kerja Enzim

Mekanisme Hipotesis Lock and Key Hipotesis Induced Fit

D. Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Kerja Enzim

1. Konsentrasi substrat
2. pH
3. Temperatur
4. Inhibitor
a) Kompetitif
b) Nonkompetitif
5. Penggolongan Enzim
1. Oksidoreduktase
2. Transferase
3. Hidrolase
4. Liase
5. Isomerase
6. Ligase
7. Restriksi
2. ENZIM LIPASE
6. Enzim Lipase (EC 3.1.1.3)
O R
R

O HO
O O Lipase O OH
3 +
H2O R OH HO
O

O R Reaksi Hidrolisis Trigliserida oleh Lipase

3. ISOLASI ENZIM
1. Pengendapan dengan amonium sulfat
Prinsip pengendapan dengan amonium sulfat berdasarkan pada kelarutan protein yang
merupakan interaksi antara gugus polar dengan molekul air, interaksi ionik protein dengan
garam dan daya tolak-menolak protein yang bermuatan sama. Kelarutan protein ada dua yaitu
proses salting in dan salting out.

Amonium sulfat merupakan garam yang umumnya digunakan untuk mengendapkan protein
karena mempunyai keuntungan yaitu:
a. memiliki daya larut yang tinggi dalam air,
b. tidak mengandung zat yang bersifat toksik,
c. protein stabil di dalam larutan amonium sulfat 2-4 M,
d. protein terlindungi dari denaturasi, dan
e. membatasi pertumbuhan bakteri serta relatif tidak mahal.
2. Dialisis
 3. Kromatografi kolom
1. Kromatografi Penukar Ion 2. Kromatografi Filtrasi Gel
4. Elektroforesis
Biomolekul polimer umumnya bermuatan listrik, sehingga dapat bergerak dalam medan listrik.
Pergerakan partikel-partikel bermuatan listrik oleh medan listrik melalui suatu pelarut disebut
elektroforesis. Fenomena ini dapat digunakan untuk karakterisasi molekul berdasarkan kecepatan
pergerakan dalam medan listrik.

β-merkaptoetanol, : mereduksi protein

sodium dedosilsulfat.β-merkaptoetanol : memecahkan semua ikatan disulfida (-S-S-)
sodium dodesilsulfat (SDS) : membentuk kompleks SDS- polipeptida

Selanjutnya rantai polipeptida ini dielektroforesis pada gel poliakrilamida. Dengan adanya arus listrik
maka semua rantai polipeptida yang bermuatan negatif akan bergerak menuju anoda. Mobilitas rantai
polipeptida merupakan fungsi ukuran molekul, sehingga akan terjadi proses pemisahan rantai-rantai
polipeptida dalam bentuk pita-pita pada gel akrilamida. Untuk menentukan letak pergerakan pita-pita
protein maka dilakukan pewarnaan.
 PEMURNIAN DAN KARAKTERISASI ENZIM LIPASE
DARI ASPERGILLUS ORYZAE PADAKOPRA BERJAMUR

1. Produksi dan isolasi enzim lipase

Produksi enzim lipase dilakukan dengan fermentasi dalam labu kocok yang mengandung
media produksi yang diinokulasi dengan larutan suspensi biakan murni Aspergillus oryzae yang
telah diaktifkan. Pepton dan minyak zaitun divariasikan konsentrasinya masing-masing, pepton
(0,5; 0,8; 1,0; 1,3 dan 1,5)% dan minyak zaitun (1, 2, 3, 4 dan 5)% serta kecepatan pengadukan
(50,100,150, 200 dan 250) rpm untuk memperoleh komposisi media produksi dan kecepatan
pengadukan optimum dalam memproduksi enzim lipase. Proses fermentasi dilakukan pada suhu
37oC selama 8 hari. Sel Aspergillus oryzae hasil fermentasi dipisahkan dari medianya dengan cara
sentrifugasi pada suhu 4oC dengan kecepatan 3500 rpm selama 30 menit. Supernatan yang
diperoleh selanjutnya digunakan sebagai enzim kasar.
Enzim Ekstrak kasar

Diuji Aktivitas dan Kadar Protein

Difraksinasi dengan (NH4)2SO4

Enzim F0-20 ... F80-100

Di dialisis dengan membran selofam

Enzim Hasil dialisis

Diuji Aktivitas dan Kadar Protein

Difraksinasi dengan kromatografi kolom penukar ion matriks Q sepharosa FF

Enzim Hasil Kromatografi Penukar Ion

Enzim Hasil Kromatografi Penukar Ion

Diuji Aktivitas dan Kadar Protein

Difraksinasi kromatografi kolom filtrasi gel dengan matriks sephadex G-75

Enzim Hasil Kromatografi Filtrasi Gel

Diuji Aktivitas dan Kadar Protein

Dikarakterisasi (pH dan suhu optimum dan BM dengan SDS-PAGE)

Enzim Murni
2. Pengujian aktivitas enzim
Aktivitas enzim lipase ditentukan dengan menggunakan metode Vorderwulbecke, et al.,
1992. Sebanyak 0,1 mL larutan enzim lipase atau blanko ditambahkan ke dalam bufer 0,89 mL
yang mengandung Tris-HCl 0.05 M pH 7,0. Selanjutnya ditambahkan 0,01 mL substrat
p-nitrofenilbutirat 0,1 M (pelarut dimetilsulfoksida), dikocok kemudian diinkubasi selama
10 menit pada suhu 37oC. Campuran reaksi diukur serapannya dengan spektrofotometer
UV-Vis pada panjang gelombang 410 nm. Aktivitas enzim lipase dihitung berdasarkan
p-nitrofenol yang terbentuk dari hasil hidrolisis enzim lipase terhadap substrat
p-nitrofenilbutirat

3. Penentuan kadar protein

Kadar protein enzim ditentukan berdasarkan metode Lowry (Colowick and Kaplan, 1957)
menggunakan serum bovine albumin (BSA) sebagai larutan standar dibaca absorbansnya pada
panjang gelombang 280 nm
Hasil Penelitian
1. Produksi dan isolasi enzim lipase
Pengujian aktivitas enzim pada setiap konsentrasi minyak zaitun, pepton dan kecepatan
pengadukan dilakukan pada tahap percobaan pendahuluan, menunjukkan bahwa aktivitas enzim lipase
yang tertinggi pada konsentrasi minyak zaitun 3%, konsentrasi pepton 1% dan kecepatan pengadukan
150 rpm yaitu 2.16 Unit/mg protein.

2. Pemurnian enzim lipase

Hasil penentun aktivitas enzim pada setiap fraksi, menunjukkan bahwa aktivitas enzim lipase
yang paling tinggi ditemukan pada fraksi amonium sulfat 60-80% kejenuhan dengan aktivitas spesifik
7,87 Unit/mg protein,
Kromatogram hasil pemisahan enzim lipase menggunakan
kromatografi kolom penukar ion

F74-77=27,50 Unit/mg protein

Kromatogram hasil pemisahan enzim lipase menggunakan
kromatografi kolom filtrasii gel sephadex G-75

F39=43,76 Unit/mg protein

Elektroforegram hasil elektroforesis gel SDS-PAGE 10%
hasil pemurnian enzim lipase dari A. oryzae

Keterangan:
Kolom 1 protein standar : Posforilase-b (116
kDa), BSA (66,2 kDa), ovalbumin (45 kDa),
karbonik anhidrase (35 kDa), rease BSP 981
(25 kDa), β-laktoglobulin (18,4 kDa), lisozim
(14,4 kDa);
Kolom 2:ekstrak kasar enzim lipase
Kolom 3:fraksi amonium sulfat (60-80)%
Kolom 4: hasil dialisis
Kolom 5: hasil Kromatografi penukar ion
Kolom 6; hasil Kromatografi Filtrasi Gel
4. APLIKASI ENZIM
 Bidang Industri Kegunaan Produk
Pangan
1. Industri susu Hidrolisis lemak susu Flavouring agents untuk produk
susu

2. Industri roti dan Meningkatkan aroma/ kualitas, Produk roti dan kue
kue memperpanjang umur simpan

3. Industri bir Meningkatkan aroma dan Produk alkohol seperti sake

mempercepat fermentasi

4. Industri bumbu Meningkatkan kualitas/tekstur Mayonaisse, bumbu-bumbu

5. Industri pngolahan Meningkatkan aroma dan mengubah Produk ikan dan daging
daging dan ikan lemak
 Bidang Industri Kegunaan Produk
Non Pangan
1. Industri kimia dan Transesterifikasi dari minyak Minyak dam lemak
obat-obatan alami
2. Industri oleokimia Hidrolisis minyak dan lemak Asam lemak bebas, digliserida,
monogliserida, dan gliserol
3. Industri detergen Analisis asam lemak Detergen untuk laundry dan
penggunaan rumah tangga

5. Kedokteran Analisis trigliserida dalam darah Diagnositics

6. Industri komestik Mengubah lemak Komestik secara umum
7. Industri kulit Mengubah lemak dalam jaringa Produk-produk kulit
n kulit hewan
 PEMURNIAN ENZIM LIPASE DARI BAKTERI LOKAL
DAN APLIKASINYA DALAM REAKSI ESTERIFIKASI

Pengukuran aktivitas esterifikasi dilakukan menggunakan Metode Hariyadi (1995)

dalam Efendi (2001) yaitu dengan cara mengesterkan 0,2 M asam laurat dan 0,2 M
lauril alkohol didalam tabung reaksi bertutup, masing-masing sebanyak 5 ml.
Selanjutnya di inkubasi pada suhu 50°C selama 15 menit. Setelah suhu konstan,
ditambahkan enzim sebanyak 0,1 ml kemudian diinkubasi selama 15 menit pada suhu
50°C. Selama reaksi esterifikasi berlangsung dilakukan pengadukan dengan stirer agar
reaksi berjalan lebih baik. Setelah reaksi esterifikasi selesai, hasil reaksi segera
disaring dengan membran selulosa 0,45 μm untuk memisahkan enzim. Filtrat yang
telah terpisah dari enzim, dianalisis kandungan asam lemak bebas (ALB).
Hasil Penelitian
Hasil Uji Aktivitas Esterifikasi Lipase

Tahap Aktivitas Esterifikasi

(mmol/ml enzim.menit)
Ekstrak Kasar Enzim 2,38
Fraksi V (80-100)% 3,81
Dialisis 4,29
Kromatografi Kolom 5,24
Thank You
Tabel Kejenuhan (NH4)2SO4