PENGENALAN AGAROSA DAN ELEKTROFORESIS GEL

POLIAKRILAMID DENGAN KEPEKAAN SENSITIVITAS

DETEKSINYA

KELOMPOK 1 :
FITRI AINIYAH
RUSINIH
DIAH
VIRGIN
 Pengenalan
Selama beberapa tahun terakhir teknik biologi molekuler, seperti reaksi
berantai polimerase
(PCR), telah banyak digunakan untuk aplikasi medis dan forensik, serta
penelitian,
deteksi dan karakterisasi organisme menular. Di bidang virologi, sudah
menunjukkan bahwa penggunaan teknik PCR menawarkan keuntungan
yang tinggi
sensitivitas dan reproduktifitas dalam deteksi genom virus dan karakterisasi
ketegangan.
Namun, sensitivitas dalam mendeteksi fragmen DNA juga terkait dengan
sensitivitas
dari matriks elektroforesis yang diterapkan untuk pengembangan produk
PCR.
Elektroforesis agarosa atau gel poliakrilamida adalah metode standar yang digunakan untuk
memisahkan, mengidentifikasi dan memurnikan asam nukleat, karena kedua gel ini bersifat berpori
di alam. Di dalam bab evaluasi sensitivitas elektroforesis gel agarosa dan poliakrilamida matriks
dalam pendeteksian produk PCR dianalisis. Untuk tujuan ini, rotavirus PCR amplikon digunakan
sebagai model.
 Rotavirus manusia telah diakui sebagai penyebab paling umum dehidrasi
diare pada bayi dan anak kecil dalam skala dunia. Virus ini ditandai
dengan keh
adiran 11 segmen RNA untai ganda dikelilingi oleh tiga yang terpisah
kerang, inti, kapsid dalam dan kapsid luar. Saat ini, rotavirus digolongkan ganda
genotipe G dan P sesuai dengan perbedaan antigen netralisasi VP7 dan VP4
yang membentuk kapsid luar virion. Dua vaksin rotavirus telah dilisensikan di internet
tahun 2006 di banyak negara.
 Keberadaan beberapa genotipe G dan atau P dalam spesimen individu dapat terjadi,
lingkungan yang unik untuk akuisisi infeksi campuran dan karenanya untuk reassortment gen
rotavirus.
Pengetahuan tentang kedua rotavirus
genotipe yang beredar di masyarakat dan kejadian infeksi campuran rotavirus adalah
penting untuk memperoleh pemahaman mendalam tentang ekologi dan distribusi
ketegangan rotavirus dan mengantisipasi perubahan antigenik yang dapat memengaruhi efektivitas
vaksin.
Tujuan ini, rotavirus G dan P genotipe ditentukan oleh ekstraksi virus
RNA dari spesimen tinja diikuti dengan analisis oleh PCR reverse-transcriptase semi-bersarang
(RT-PCR) dengan primer spesifik untuk wilayah gen yang mengkode VP7 atau VP4. Produk PCR
spesifik genotipe kemudian dianalisis pada agarosa atau gel poliakrilamida
diikuti oleh pewarnaan ethidium bromide atau pewarnaan perak.
 Matriks yang digunakan untuk elektroforesis harus memiliki ukuran pori yang dapat
disesuaikan tetapi teratur, dan dalam kimia,dan pilihan gel mana untuk digunakan tergantung
pada ukuran
fragmen-fragmen yang dipisahkan (guilliatt, 2002).
 Karakteristik umum dari matriks agarosa dan poliakrilamida

1. Elektroforesis gel Agarosa (AGE)

Agarosa adalah polimer linier alami yang diekstraksi dari rumput laut yang membentuk matriks
gel oleh ikatan hidrogen bila dipanaskan dalam buffer dan dibiarkan dingin. Untuk sebagian
besar aplikasi, hanya diperlukan agarosa komponen tunggal dan tidak diperlukan katalis
polimerisasi.Oleh karena itu, gel agarosa sederhana dan cepat untuk disiapkan (Chawla, 2004).
Keduanya merupakan media populer untuk pemisahan asam nukleat berukuran sedang dan besar
dan memiliki berbagai pemisahan tetapi daya penyelesaian yang relatif rendah, karena pita
terbentuk di gel cenderung kabur dan menyebar terpisah. Ini adalah hasil dari ukuran pori dan
tidak dapat sebagian besar dikontrol.
 Keuntungan dan kerugian lainnya dari menggunakan gel agarosa untuk DNA
elektroforesis diringkas
dalam tabel 1 (stellwagen, 1998).

keuntungan kerugian
Media gel tidak beracun Biaya agarosa tinggi

Gel cepat dan mudah dilemparkan Pita kabur

Baik untuk memisahkan molekul DNA besar Pemisahan yang buruk dari berat molekul rendah
sampel

Dapat memulihkan sampel dengan melelehkan

gel,

mencerna dengan enzim agarosa atau mengobati

dengan garam chaotropic
2. Elektroforesis gel poliakrilamid (PAGE)

Gel poliakrilamida adalah gel yang terikat secara kimiawi yang dibentuk oleh polimerisasi
akrilamida dengan zat pengikat-silang, biasanya N, n-metilenebisakrilamida. Reaksinya adalah
polimerisasi radikal bebas, biasanya dilakukan dengan amonium persulfat sebagai inisiator dan N,
N, N ', n-tetramethylethylendiamine (TEMED) sebagai katalis. Walaupun
gel umumnya lebih sulit untuk disiapkan dan ditangani, melibatkan waktu yang lebih lama persiapan
daripada gel agarosa, mereka memiliki keunggulan utama dibandingkan gel agarosa.

Mereka punya daya penyelesaian yang lebih besar, dapat mengakomodasi jumlah DNA yang lebih
besar tanpa kehilangan yang signifikan dalam resolusi dan DNA yang pulih dari gel poliakrilamida
sangat murni (guilliatt,2002). Selain itu, ukuran pori gel poliakrilamida dapat diubah dengan mudah
dan mode yang dapat dikendalikan dengan mengubah konsentrasi kedua monomer. Poliakrilamida
adalah neurotoksin (bila tidak dipolimerisasi), tetapi dengan perawatan laboratorium yang tepat
tidak lebih berbahaya daripada berbagai bahan kimia yang biasa digunakan.
 Beberapa kelebihan dan kekurangan menggunakan gel poliakrilamida
untuk elektroforesis DNA
digambarkan pada tabel 2 (stellwagen, 1998).

keuntungan kerugian
Ikatan silang stabil secara kimia Monomer toksik
Pita tajam Gel membosankan untuk disiapkan dan
sering bocor

Baik untuk pemisahan fragmen-fragmen Perlu gel baru untuk setiap percobaan
dengan berat molekul rendah
3. Konsentrasi gel

• Konsentrasi gel agarosa

Persentase agarosa yang digunakan tergantung pada ukuran fragmen yang harus diselesaikan.
konsentrasi agarosa disebut sebagai persentase agarosa terhadap volume buffer (b / v),dan gel agarosa
biasanya dalam kisaran 0,2% sampai 3% (Smith, 1993). Semakin rendah konsentrasi agarosa, semakin
cepat fragmen DNA bermigrasi. Secara umum, jika tujuannya adalah untuk pemisahan fragmen DNA
besar, menggunakan konsentrasi agarosa rendah, dan jika tujuannya adalah untuk memisahkan fragmen
DNA kecil, menggunakan konsentrasi agarosa tinggi.
Tabel 3. Konsentrasi gel agarosa untuk menyelesaikan molekul DNA linier.

Konsentrasi agarosa (%) Kisaran ukuran DNA (bp)

0,2 5000-40000
0,4 5000-30000

0,6 3000-10000

0,8 1000-7000

1 500-5000
1,5 300-3000
2 200-1500
3 100-1000
• Konsentrasi gel poliakrilamida
Memilih konsentrasi akrilamida sangat penting untuk pemisahan molekul yang Optimal, memilih
konsentrasi akrilamida yang sesuai dan ikatan silang agen, methylenebisacrylamide, ukuran pori
dalam gel dapat dikontrol. Dengan meningkatnya Total persentase konsentrasi (T) monomer
(akrilamida plus cross-linker) dalam gel,ukuran pori berkurang dalam hubungan yang hampir linier.
(Hames, 1998). Hubungan Persentase total monomer yang diwakili oleh cross-linker (C) lebih
kompleks.
Para peneliti telah menetapkan nilai C 5% (19: 1 akrilamida / bisakrilamida) untuk sebagian besar
bentuk dari denaturasi elektroforesis DNA dan RNA, dan 3,3% (29: 1) untuk sebagian besar protein,
asli gel DNA dan RNA. Untuk optimasi, gel poliakrilamid 5% hingga 10% dengan pengait silang
variabel dari 1% hingga 5% dapat digunakan. Menghubungkan silang rendah (di bawah 3% C)
menghasilkan "gel serat panjang"dengan ukuran pori meningkat (glavač & dean, 1996). Konsentrasi
akrilamida rendah / bisakrilamida penanganan gel sulit karena
mereka berlendir dan kurus.
 Tabel 4 memberikan perbandingan DNA/ RNA yang direkomendasikan dan
persentase gel untuk rentang ukuran molekul yang berbeda.

Acrylamide / Bis Gel% DNA Asli / RNA(bp) Didenaturasi

Rasio DNA / RNA (bp)

19: 1 4 100-1500 70-500

6 60-600 40-400
8 40-500 20-200
10 30-300 15-150
12 20-150 10-100

29: 1 5 200-2000 70-800

6 80-800 50-500
8 60-400 30-300
10 50-300 20-200
12 40-200 15-150
20 <40 <40
4. Sistem buffer elektroforesis
Pemisahan efektif asam nukleat dengan elektroforesis gel agarosa atau poliakrilamida
tergantung pada pemeliharaan ph yang efektif dalam matriks. Buffer adalah
bagian integral dari teknik elektroforesis. Selain itu, mobilitas elektroforesis
DNA dipengaruhi oleh komposisi dan kekuatan ionik (kandungan garam) dari elektroforesis
buffer (somma & querci, 2006). Tanpa garam, konduktansi listrik minimal dan DNA nyaris tidak
bergerak. Dalam buffer dengan kekuatan ionik tinggi, konduktansi listrik sangat efisien dan
sejumlah besar panas dihasilkan.
• Dissociating dan non-dissociating systems buffer
Analisis elektroforetik asam nukleat untai tunggal oleh struktur sekunder diasumsikan oleh molekul-
molekul ini. Pemisahan berdasarkan berat molekul membutuhkan masuknya agen denaturasi, yang
membuka untai DNA atau RNA dan menghapus pengaruh bentuk pada mobilitas mereka. Asam nukleat
membentuk struktur yang distabilkan oleh hidrogen ikatan antara basis.
Umumnya sistem penyangga yang dipisahkan termasuk urea dan formamida sebagai denaturants dna.
DNA terdenaturasi bermigrasi melalui gel-gel ini pada tingkat yang hampir sepenuhnya bergantung
pada komposisi dan urutan dasarnya. Mendenaturasi atau memisahkan sistem buffer untuk
protein termasuk penggunaan natrium dodesil sulfat (SDS).
 Dalam sistem SDS-PAGE,
dikembangkan oleh laemmli (1970), protein dipanaskan dengan SDS sebelum elektroforesis
sehingga
kepadatan muatan semua protein dibuat kira-kira sama. Pemanasan di SDS, anionik
deterjen, mendenaturasi protein dalam sampel dan berikatan erat dengan molekul yang tidak
dikeraskan
(dengan muatan negatif bersih). Akibatnya, ketika sampel ini dielektroforesis, protein
terpisah menurut massa saja, dengan efek yang sangat kecil dari perbedaan komposisi.
Molekul DNA bermuatan negatif; oleh karena itu penambahan SDS dalam gel
persiapan hanya dengan tujuan meningkatkan daya resolusi band (day & humphries, 1994).

Dengan tidak adanya denaturants, DNA beruntai ganda (dsdna), seperti produk PCR, tetap ada
struktur heliks ganda, yang memberinya bentuk seperti batang saat bermigrasi melalui gel.
Selama elektroforesis molekul asli dalam sistem buffer non-disosiasi, pemisahan
berlangsung pada tingkat yang kira-kira berbanding terbalik dengan log10 dari ukurannya.
• Sistem buffer kontinu dan terputus-putus
Dalam sistem buffer kontinu, identitas dan konsentrasi komponen buffer adalah
sama di kedua gel dan tangki. Sistem penyangga ini digunakan untuk sebagian besar formulir
elektroforesis gel agarosa DNA, yang umumnya mengandung EDTA (ph 8.0) dan trisacetate
(TAE) atau tris-borate (TBE) pada konsentrasi sekitar 50mm (ph 7,5-7,8). TAE lebih murah, tetapi
tidak sestabil TBE. Selain itu, TAE memberikan resolusi yang lebih baik.
Pita DNA dalam pemisahan elektroforesis pendek dan sering digunakan ketika isolasi DNA
selanjutnya yang diinginkan. TBE digunakan untuk elektroforesis gel poliakrilamida dari
molekul yang lebih kecil DNA berat (MW <2000) dan elektroforesis gel agarosa dari DNA
yang lebih panjang di mana tinggi resolusi tidak penting.
Sistem terputus-putus (multifasik) menggunakan buffer yang berbeda untuk tangki dan gel, dan seringkali
dua buffer berbeda di dalam gel. Sistem terputus berkonsentrasi atau "menumpuk" sampel
menjadi zona yang sangat sempit sebelum pemisahan, yang menghasilkan peningkatan ketajaman pita dan
resolusi. Gel tersebut dibagi menjadi gel "susun" atas dengan persentase rendah akrilamida
dan ph rendah (6,8) dan gel pemisah dengan ph 8,8 dan pori-pori jauh lebih kecil (lebih tinggi
persentase akrilamida). Sedangkan buffer tangki mengandung glisin sebagai anionnya, pada ph
8.8. Keuntungan utama dari sistem buffer diskontinyu daripada sistem buffer kontinu
adalah bahwa sistem gel ini dapat mentoleransi volume sampel yang lebih besar (rubin, 1975).

5. Memuat buffer
Ini adalah buffer yang akan ditambahkan ke fragmen DNA yang akan di-elektroforesis. Buffer ini
mengandung gliserol atau sukrosa untuk meningkatkan kepadatan larutan DNA; jika tidak,
sampel akan larut dalam menjalankan tangki penyangga dan tidak tenggelam ke dalam kantong
gel. Gel loading buffer juga mengandung pewarna yang memudahkan pengamatan sampel selama
pengisian gel dan elektroforesis, seperti bromophenol blue atau xylene cyanol. Komponen dan
konsentrasi 6X loading dye yang biasa digunakan adalah: 0,25% bromophenol blue, 0,25% xylene
cyanol FF, 30% gliserin; atau 0,25% bromophenol blue, 50 mm EDTA, sukrosa 0,4%.
6. Tegangan / arus diterapkan
Semakin tinggi tegangan / arus, semakin cepat migrasi DNA. Jika tegangan terlalu tinggi, goresan pita,
terutama untuk dna≥12-15kb, dapat terjadi. Tegangan tinggi menyebabkan peningkatan suhu dan arus
buffer dalam waktu yang sangat singkat.. Oleh Karena itu, sangat direkomendasikan tidak melebihi
5-8 V / cm dan 75 ma untuk gel ukuran standar atau 100 ma untuk mini gels. Di sisi lain, ketika
tegangan terlalu rendah, mobilitas DNA kecil (≤1kb) adalah berkurang dan pelebaran pita akan
terjadi karena dispersi dan difusi.

7. Memvisualisasikan dna
setelah elektroforesis selesai, ada berbagai metode yang dapat digunakan
untuk membuat spesies dna yang terpisah dalam gel terlihat oleh mata manusia.
• Pewarnaan ethidium bromide (ebs)
Lokalisasi DNA dalam gel agarosa dapat ditentukan secara langsung dengan pewarnaan
konsentrasi rendah pewarna etidium bromida fluoresen interkalasi di bawah ultraviolet
cahaya.
• Pewarnaan perak (SS)
Pewarnaan perak adalah metode yang sangat sensitif untuk visualisasi asam nukleat dan protein
band setelah pemisahan elektroforesis pada gel poliakrilamida. Asam nukleat dan protein
mengikat ion perak, yang dapat direduksi menjadi butiran logam perak yang tidak larut. Perak yang
cukup deposisi terlihat sebagai pita coklat gelap pada gel.
8. Tujuan penelitian ini
Tujuan dari penelitian yang disajikan dalam bab ini adalah untuk menganalisis pengaruh gel
matriks elektroforesis (agarosa dan poliakrilamida) dan sistem pewarnaan. (Etidium bromida dan
pewarnaan perak) dalam deteksi amplikon genotipe G rotavirus (produk dari ds DNA).

9. Bahan dan metode

• Koleksi genotipe amplikon rotavirus G
Genotipe G oleh RT-PCR diikuti oleh heminested-pcr. Secara singkat, diekstraksi RNA dari
sampel tinja secara terbalik ditranskripsi menjadi vp7-gen cdna panjang penuh dengan primer
generik beg9 / end9. Kemudian, produk cdna digunakan sebagai template untuk PCR vp7-
amplifikasi dengan pasangan primer beg9 / end9 yang sama.
 Amplikon yang diperoleh dianalisis secara komparatif oleh metode elektroforesis gel
agarosa standar dan pewarnaan etidium bromida (AGE / EBS) dan elektroforesis gel
poliakrilamid dan pewarnaan perak (PAGE / SS). Amplikon itu yang menunjukkan hasil
sumbang diurutkan untuk memverifikasi spesifisitas
pita divisualisasikan.

• Mempersiapkan, menjalankan dan mewarnai 2% gel agarosa

Ukuran yang diharapkan dari produk PCR spesifik genotipe adalah 749bp (G1), 652bp (g2),374bp
(G3), 583bp (G4), 885bp (G8), dan 306bp (G9). Gel agarose dirawat dengan etidium bromida
untuk visualisasi selanjutnya dari amplikon DNA (konsentrasi akhir 0,5ug / ml). Ethidium bromide
ditambahkan ke sediaan gel untuk meminimalkan limbah yang mengandung etidium bromida. Gel
agarosa di-elektroforasi dalam buffer TBE (0,09M tris-borate, 0,002M EDTA) selama 30-60 menit
pada 80-100V. Setelah dijalankan, produk PCR divisualisasikan dalam transilluminator UV.
 Bahan Kuantitas / volume

Agarose 2 gr 2 gr

Ethidium bromide (10 mg / ml) 5 ul

Air deionisasi 100 ml

• Mempersiapkan, menjalankan dan menodai 10% gel poliakrilamida

ukuran amplikon yang diharapkan PCR berada dalam kisaran 306-749bp, gel
poliakrilamida 6% konsentrasi harus digunakan, karena konsentrasi ini
direkomendasikan untuk pemisahan produk antara 80 dan 800bp.
 Gel pemisah Gel susun

Bahan volume Bahan volume

Acrylamide 30% 2,5 ml Acrylamide 30% 400 μl
Bisacrylamide 1% 0,95 ml Bisacrylamide 1% 250 μl
Tris-hcl 3M (ph 8,7) ) 0,95 ml Tris-hcl 1M (ph 6,8) 315 μl
SDS 10% 75 μl SDS 10% 25 μl
Air deionisasi 3,2 ml Air deionisasi 1,5 ml
TEMED 5 μl Temed 2.5 μl
Amonium persulfat 10% 100 μl Amonium persulfat 10% 25 μl
Volume akhir 7,78 ml Volume akhir 2,52 ml
 Durasi setiap langkah perak pewarnaan ditunjukkan
pada Tabel 7.

Langkah Larutan Waktu

Setelah elektroforesis, gel 1 Memperbaiki larutan 30 menit

poliakrilamida diwarnai dengan 2 Air dideionisasi 2 menit
perak nitrat mengikuti Herring et al.
(1982) metode. Itu terdiri dari: i) 3 Pewarnaan larutan 30 menit
fiksasi fragmen DNA dalam etanol
4 Air terdeionisasi 10 detik
10% dan 0,5% asam asetat glasial,
ii) pewarnaan dengan larutan perak
5 Larutan pengembang 10-15 menit (hingga
nitrat 0,011M, iii) pengembangan
dengan 0,75M NaOH dan 7,6% pita terlihat)
formaldehid, dan iv) menghentikan
proses dengan glasial 5% asam 6 Menghentikan Larutan
asetat ketika gambar yang diinginkan
tanpa batas
telah dikembangkan.
Setelah pewarnaan perak, gel poliakrilamida dikeringkan dan diawetkan. Setiap
poliakrilamida gel ditempatkan di antara dua kertas plastik alami (satu menempel
pada gelas) dan direndam dalam larutan pengeringan yang mengandung 69% metanol
dan 1% gliserol. Gel dikeringkan di suhu kamar untuk 24-48 jam (Giordano et al.,
2008).
Hasil
• Deteksi genotipe Rotavirus G oleh AGE / EBS dan PAGE / SS
Di bawah kondisi eksperimental yang dijelaskan, analisis oleh AGE / EBS dari rotavirus
590 sampel positif menunjukkan bahwa total 32 (5,4%) sampel tidak menampilkan tipe
PCR G. produk amplifikasi setelah elektroforesis gel. Dari 558 sampel yang
mengungkapkan PCR amplikon, 324 (58,1%) adalah infeksi genotipe G tunggal dan 234
(41,9%) genotipe G campuran infeksi (dua atau lebih amplikon terungkap dalam sampel
yang sama). Di samping itu, Analisis PAGE / SS dari amplikon PCR mengungkapkan bahwa
semua sampel positif rotavirus (n = 590) menunjukkan setidaknya satu amplikon. Dari 590
sampel, 318 (53,9%) adalah G tunggal
Diskusi
Pada perbandingan berdampingan yang disajikan dalam penelitian ini, metode deteksi amplikon
mengungkapkan secara umum bahwa jumlah genotipe yang lebih tinggi (11,4%) dapat dideteksi oleh
halaman / SS (n = 894) dibandingkan dengan AGE / EBS (n = 792). Dalam banyak kasus, produk PCR
divisualisasikan sebagai pita tidur oleh PAGE / SS dan kemudian dikonfirmasi sebagai spesifik dengan
urutan nukleotida, terjawab oleh teknik standar (AGE / EBS).