Anda di halaman 1dari 41

PIROGEN

SEJARAH PENEMUAN
1. Tahun 1675-1685 Anton van Leeuwenhock menemukan
mikroskop menemukan fakta baru : kehidupan yg
mikroskopik
2. Pembuktian pasteur :fermentasi yg dilakukan oleh
mikroorganisme
3. Glasgow membuktikan teori jamur
4. Edward Jenner mengembangkan vaksin pertama dari
virus cacar pada sapi 100 tahun sebelum Pasteur,
dengan cara memanaskan basil dari penyakit anthrax
bacilli dan simpul saraf rabies dari kelinci yang
terinfeksi yang merupakan pengembangan vaksin
untuk mengobati anthrax pada domab (1881) dan
rabies pada manusia (1885),
SEJARAH PENEMUAN
5. Pada akhir tahun 1870, Robert Koch membuktikan bahwa
jenis masing-masing mikroba tergantung pada
penyakitnya seperti anthrax dan tuberkulosis. Dan
mengeluarkan postulat bahwa keadaan yang disebabkan
oleh organisme menyebabkan penyakit tertentu :
a. Organisme yang muncul harus diperhatikan pada setiap
keadaan yang menjelaskan perubahan patologi dan gejala
klinis
b. Organisme tidak harus dihubungkan dengan penyebab
penyakit lain
c. Setelah diisolasi dari tubuh dan dikembangbiakan dalam
koloni tunggal, organisme dapat melawan penyakit pada
hewan
Peneliti menyelidiki mekanisme demam dan
bakteri yang menyebabkannya merupakan
dasar lahirnya teori dan metode mikrobiologi
and methods and sebagai bahan yang secara
terus menerus diselidiki sampai sekarang pada :
a.Pengobatan umum pada infeksi yang
disebabkan luka
b.Toksin dari bakteri
c.Terapi demam
d.Pemurnian kimia dan uraian struktural
endotoksin
e.Karakterisasi molekular modern dari
lipopolisakarida (LPS)
KLASIFIKASI PIROGEN
Dibagi berdasarkan asal usulnya dari dalam dan luar tubuh :
1. “endogenous endotoxin” merupakan endotoksin
lingkungan dan berbeda dengan “endogenous pyrogen”
(EP) and “endogenous mediator,” dimana merupakan
substansi yang dihasilkan oleh tubuh dan merupakan
penyebab inflamasi tubuh, koagulasi dan mekanisme
demam. Disebut cytokines.
2. Exogenous pyrogen adalah senyawa asing pada tubuh
sebagai respon terhadap sediaan injeksi atau yang
menyebabkan infeksi seperti mikroba pirogen yang sering
disebut dengan endotoxin. Nonmicrobial exogenous
pyrogen non mikroba seperti senyawa yang menyebabkan
efek farmakologi (antigen) sebagai serum albumin
manusia.
MEKANISME DEMAM
• Hal yang harus diperhatikan dari endotoksin yang berasal dari
suatu sediaan parenteral selama pembuatan sehingga harus
dikontrol untuk melawan semua pirogen yang menkontaminasi.
Hal pertama yang harus diperhatikan untuk mengatasi pirogen
adalah air dan bahan yang digunakan dan harus melewati uji LAL
(Limulus Amebocyte Lysate) atau uji pirogen yang tertera pada
buku standar (FI atau USP)
• Endotoxin, merupakan LPS yang dihasilkan dinding sel bakteri
gram negatif yang tahan terhadap pemanasan ekstrim, aktif
setelah sterilisasi uap dan mudah melewati penyaring bakteri.
Hanya dapat mati pada temperatur 200oC selama satu jam.
Atau pemanasan yang dikombinasi dengan penyesuaian pH.
MOLEKUL LPS
• Molekul LPS merupakan struktur yang kuat dan
larut dalam lemak yang menempel pada
permukaan hidrofobik seperti gelas, plastik dan
arang. Dalam larutan, LPS secara spontan
membentuk lapisan bilayers yang terdiri dari
bagian kepala lipid hidrofobik dan ujungnya asam
lemak yang tersembunyi di bagian dalam dan
bagian atas dan sisi yg lain polisakarida hidrofilik
yang larut pada bagian larutan sehingga potensial
mempengaruhi kestabilan sediaan.
LIPOPOLYSACCHARIDES INTERACTION
WITH CELL MEMBRANES
Terdapat tiga tipe interaksi LPS dengan
membran sel :
a.Berikatan dengan reseptor pada sel yang
merupakan suatu protein terlarut
membentuk komleks dengan LPS,
b.Berikatan dengan reseptor membran
c.Langsung berinteraksi dengan membran
LPS.
PERLAKUAN YANG PENTING UNTUK MENEMUKAN
DAN MENGIDENTIFIKASI KONTAMINAN
• Proses pembuatan obat-obat parenteral dapat dibagi
menjadi dua kategori :
a. Sterilisasi pada saat pembuatan, pengisian, packing dan
sterilisasi akhir
b. Sterilisasi dengan teknik aseptis selama pembuatan dan
pengisian tanpa sterilisaasi akhir
• Kelembaban merupakan sumber dari kontaminasi :
a. Udara sekitar
b. Pembuatan peralatan
c. Wadah sediaan
d. Personil yang membuat sediaan
e. Air dan drainase/pengairan
UJI PYROGEN
• Tergantung pada sensitifitas dari kelinci yang
diberikan beberapa sediaan diduga
terkontaminasi dengan pyrogen
• Tujuan : diharapkan memberikan respon yang
sama terhadap manusia dan dipercaya serta
cocok untuk mendeteksi substansi pyrogen
secara umum.
• Kerugian dari metode in vivo ini :
a. Mahal dalam pemeliharaan kelinci,
b. Tidak dapat melihat jumlah kontaminan,
c. Kurang sensitif terhadap uji LAL,
d. Membutuhkan waktu untuk pemeriksaan (tahunan)
dan
e. Variasi yang banyak secara biologi
• Tes gel-clot bacterial endotoxin
adalah Test yang menggabungkan uji
secara in vivo dan in vitro yang
dikembangkan dan dioptimalkan dan
yang memvalidasi air atau pelarut
yang digunakan pada sediaan
parenteral serta uji terhadap kualitas
sediaan.
DEPYROGENASI
• adalah (penghilangan, reduksi
atau destruksi) endotoksin
terhadap sediaan dan wadah
serta proses pembuatannya.
• Secara tradisional, depyrogenasi
pertama adalah dengan pembakaran
panas kering endotoksin dari bahan
pemanasan kering yang dapat
bertahan dengan siklus panas kering
yang dibutuhkan untuk
menghancurkan molekul LPS.
PROSES DEPYROGENASI TERBAGI ATAS
DUA KELOMPOK :
1.Inaktivasi
– Pemanasan basah dan kering
– Radiasi ionisasi
– Inaktivasi secara kimia (seperti penggunaan asam
atau basa kuat)
– Oksidasi (ex: hydrogen peroxide)
– Polymyxin B (PMB)
– Inaktivasi secara biologi
2. Pembersihan
• Menurut ukuran partikel endotoksin ,
(ultrafiltration, penggantian ion,
penghilangan atau penggumpalan
melalui filtrasi)
• Pengikatan (arang aktif, LPS yang
diikat dg suatu protein)
Proses depyrogenasi (seperti metode
sterilisasi) artinya konstruksi D (death or
destruction pada endotoxin).
Kondisi minimum untuk membunuh
endotoksin E. coli :
1. 300OC, 11 minutes
2. 250OC, 75 minutes
3. 210OC, 195 minutes
4. 175OC, 600 minutes
Untuk depyrogenation, variabel yang
mempengaruhi reduksi endotoxin:
1.Jenis endotoksin (sumber dan tempat
kerja, yang berasal dari proses
pembuatan yang berbeda aplikasi
serta metodenya).
2. Jumlah endotoxin (jumlah pada
umumnya 1000 to 100,000 IU per
component).
3. Jenis bahan yang mengandung
endotoksin (halus atau kasarnya
karet/polimer untuk vial atau wadah
gelas)
4.Metode ekstraksi yang digunakan
untuk menghilangkan endotoksin
sebelum dan sesudah pelaksanaan
depyrogenation

5. Variasi potensi endotoksin dalam


konsentrasi tinggi pada larutan

6. Efek yang mengganggu analisa yang


berasal dari peluluhan atau daerah
bahan pembersih yang mungkin
berasal dari polimer atau gelas akibat
pemanasan
7. Proses pemeliharaan yang terdiri dari
beberapa variabel yaitu tutup vial atau
alat pembersih yang mempengaruhi
campuran recovery (sejumlah besar
dari berbagai proses tersebut
merupakan variabel yang digunakan
sebagai indikator sederhana terhadap
pengukuran waktu dan temperatur
yang digunakan)
• Sterilisasi :
suatu proses dg metode ttt yg bertujuan
mematikan semua organisme hidup
(vegetatif & non-vegetatif) –spora bakteri
yg > resisten thd desinfektan maupun
panas
• Desinfeksi :
proses yang menggunakan suatu bahan
(kimia)yg dpt membunuh mikroorganisme
patogen kecuali spora bakteri, virus &
beberapa strain bakteri resisten
persenyawaan kimia  desinfektan
desinfektan + sterilisasi  benda mati
• Antiseptik :
desinfektan non toksik, dipakai untuk kulit,
mukosa atau jaringan hidup lain
Macam-macam sterilisasi :
1. Sterilisasi panas kering
2. Sterilisasi dengan panas uap
3. Sterilisasi dengan ultraviolet
4. Sterilisasi dengan sinar pengion
5. Sterilisasi dengan gas kimia
6. Sterilisasi dengan filtrasi
7. Sterilisasi dengan bahan kimia
STERILISASI secara MEKANIK
• Filtrasi, microfilter : 2,5 - 3μ / 0,22 - 0,45 μ
• Prinsip : Cairan lewat saringan berpori (ditekan
dengan gaya sentrifugasi atau pompa vakum).
Bakteri tertahan pada saringan , Virus tidak
tersaring.
• Bahan tidak tahan panas atau mudah menguap:
vitamin, antibiotik, Enzim
• Langkah :
 Sterilkan tempat yang digunakan sebagai wadah
 Media disaring menggunakan mikrofilter (2,5 - 3μ) dan
langsung ditempatkan pada wadah steril
 Ditutup rapat dengan aluminium foil
 Dilakukan dalam laminar flow
1. Pemanasan
a. Pemijaran (dengan api langsung):
membakar alat pada api secara langsung
contoh alat : jarum inokulum, pinset, batang L,
b. Panas kering:
Oven (60-180oC).
– untuk alat dari kaca : erlenmeyer, tabung reaksi dll.
c. Uap air panas:
Konsep mirip mengukusuntuk Bahan yang mengandung
air (tidak terjadi dehidrasi).
d. Uap air panas bertekanan :
autoklaf
2. Penyinaran dengan UV
contoh :
–membunuh mikroba pada
permukaan interior Safety
Cabinet
–sterilisasi ruangan
Langkah :
– Peralatan dicuci dengan air tawar dan detergen
– Letakkan pada rak, tunggu hingga kering
– Tabung reaksi :
 autoclave : tutup lubang dg kapas, bungkus dg kertas
perkamen
 oven : masukkan tabung stainless steel, tanpa bungkus kertas
perkamen
– Pipet ukur : tutup pangkal dengan kapas, bungkus dg kertas
perkamen
– Peralatan disusun dalam autoclave / oven, tutup, operasikan.
• Jangan dengan autoklaf :
- Bahan tidak tahan panas seperti serum,
vitamin, antibiotik, dan enzim
- Pelarut organik, seperti fenol
• - Buffer dengan kandungan detergen, seperti
SDS
• Digunakan untuk peralatan gelas : beaker glass,
pipet ukur dan labu erlenmeyer.
• Alat gelas yang disterilisasi dengan udara panas
tidak akan timbul kondensasi sehingga tidak ada
tetes air (embun) didalam alat gelas.
• Bungkus alat-alat gelas dengan kertas perkamen
atau aluminium foil
• Atur pengatur suhu oven menjadi 180oC dan alat
disterilkan selama 2-3 jam.
A. Sterilisasi alat besar
• Bahan : HCl, HgCl2 10%, Alkohol, Formalin, Phenol, Chlorin
• Langkah :
Cuci alat dg air tawar dan detergen
Dg HCl : rendam dalam HCL 10% selama 2 hari
Dg Chlorin : rendam dlm larutan chlorin 150 mg/l selama
12 – 24 jam
Netralisir dg Na-Thiosulfat 40 – 50 mg/l
Bilas dengan air tawar sampai bau hilang
• Contoh :
Propilen oksida (C3H6O)
Gas klorin (Cl2)
Klorin dioksida (ClO2)
Ozon (O3)
Etilen oksida (C2H4O)
• Keterangan :
Digunakan untuk bahan yang sensitif terhadap panas atau kelembaban
Tidak korosif terhadap bahan, dapat digunakan untuk plastik
Mahal, toksik, karsinogenik
• Dengan sinar gama (disintegrasi radioaktif dari
radioisotop) dan
• sinar – sinar katoda
• penggunaan tehnik – tehnik ini terbatas
karena memerlukan peralatan yang sangat
khusus
• Dilakukan pada produk – produk dan wadah –
wadah.
Keunggulan,meliputi
1. reaktivitas kimia rendah,
2. residu rendah yang dapat diukur,
dan
3. kenyataan yang membuktikan
bahwa variabel yang dikendalikan
lebih sedikit
• Tidak termasuk salah satu cara penyeterilan secara
mutlak,

• Merupakan cara penanganan bahan steril dengan


tehnik yang dapat memperkecil kemungkinan
terjadinya cemaran bakteri ( kontaminsi bakteri )
hingga seminimum mungkin
Dilakukan terhadap untuk fasilitas
pengisian atau proses aseptik lainnya
yang didesain, yang divalidasi dan
dipelihara dengan benar, terutama
ditunjukan pada :
• lingkungan udara yang bebas dari
mikroba viabel yang dirancang dengan
benar untuk memungkinkan
pemeliharaan yang efektif dari unit
alat pemasok udara.
• tersedianya tenaga pekerja terlatih,
yang dilengkapi dan mengenakan
pakaian kerja yang memadai.