Elektroforesis transfer protein dari poliakrilamida untuk

nitroselulosa lembar : Prosedur dan beberapa aplikasi.

SANDY CICI VITNANTIWI (2 ITP C/201610220311112)
Gel poliakrilamid elektroforesis

telah menjadi alat standar di setiap laboratorium di mana protein

dianalisis dan dimurnikan. Paling sering, jumlah dan lokasi dari protein
yang menarik dan pewarnaan kemudian cukup. Namun, juga
mungkin penting untuk mengkorelasikan aktivitas protein dengan
band tertentu pada gel. Enzimatik dan kegiatan mengikat kadang
dapat terdeteksi di situ dengan membiarkan substrat atau ligan
berdifusi ke dalam gel (1, 2). Dalam immunoelectrophoresis, antigen
diperbolehkan untuk berdifusi (3) atau elektroforesis bergerak (4)
terhadap antibodi. Sebuah endapan kemudian dibentuk di mana
antigen dan antibodi berinteraksi. Modifikasi telah dijelaskan di mana
antigen tersebut diendapkan dengan langsung merendam matriks
pemisahan di antiserum (5, 6).
Analisis DNA kloning telah merevolusi (7) oleh kemampuan untuk
fraksinasi DNA elektroforesis gel rylamide / agarosa polyac- pertama
dan kemudian untuk mendapatkan replika setia pola gel asli oleh
blotting DNA ke selembar nitroselulosa yang itu adalah bergerak. DNA
amobil kemudian dapat dianalisis dengan hibridisasi in situ. Kekuatan
bergerak array dua dimensi telah diperpanjang untuk analisis protein
dengan menggunakan lembaran plastik antibodi berlapis untuk
mengambil yang sesuai antigen dari koloni pada agar piring (8).
Sharon et al. (9) telah menggunakan antigen-dilapisi lembaran lulose
nitrocel- untuk mengambil antibodi yang disekresikan oleh klon
hibridoma yang tumbuh di agar.
Dalam laporan ini menjelaskan
prosedur :
Prosedur untuk transfer protein dari gel poliakrilamida untuk
selembar nitroselulosa sedemikian rupa bahwa replika setia pola
originalgel diperoleh. Berbagai prosedur analitis dapat diterapkan
pada protein imobilisasi. Dengan demikian, tility versa- ekstrim
nitroselulosa mengikat tes dapat dikombinasikan dengan resolusi tinggi
gel poliakrilamid elektroforesis. The cedure pro membawa analisis
protein kekuatan bahwa Southern (7) teknik telah dibawa ke analisis
DNA.
BAHAN DAN METODE

Immunogens dan Imunisasi Prosedur. Escherichia coli ribosom protein

L7 dan L12 diekstraksi (10) dari 50S subunit dan dimurnikan seperti yang
dijelaskan (11) dengan kromatografi pertukaran ion pada carboxymethyl-
dan DEAE-selulosa. Antibodi dibesarkan di kambing dengan menyuntikkan
250 jig protein diemulsikan dengan adjuvant lengkap Freund intrakutan
didistribusikan ke beberapa situs. vaksin Bacillus pertusis (1,5 ml vaksin
Bordet-Gengou, Schweizerisches Serum- und Impfinstitut, Bern, Swiss)
diberikan subkutan dengan setiap injeksi antigen. suntikan booster
memformulasikan yang sama diberikan pada hari 38, 79, dan 110.
Binatang wasbled pada hari 117. Subunit dari ribosom hati ayam (12)
digabungkan dalam jumlah molar yang sama, dan 200-IAG aliquots
emulsi dengan 125 Al adjuvant lengkap Freund disuntikkan pada satu
traperitoneal in dan empat situs subkutan ke BALB / c tikus. suntikan
booster 400, ig ribosom di saline diberi intraperitoneal pada hari 33, 57, 58,
dan 59. Hewan-hewan itu berdarah pada hari 71.
Elektroforesis Prosedur Blotting

Protein pertama kali mengalami elektroforesis di hadapan urea baik

dalam dua dimensi (12) atau dalam gel slab satu dimensi yang sesuai
dengan dimensi kedua dari sistem dua dimensi yang sama. Protein yang
kemudian dipindahkan ke lembaran nitroselulosa sebagai berikut.
perakitan fisik yang digunakan ditunjukkan diagram pada Gambar. 1.
Selembar nitroselulosa (0,45, ukuran pori im dalam bentuk roll, Millipore)
sempat dibasahi dengan air dan diletakkan pada gosok pad (Scotch-
Brite) yang didukung oleh jaringan plastik kaku (pakai mikropipet tray,
Laboratorium Medis Otomasi , Inc., New York). gel yang akan dihapuskan
dimasukkan pada lembar nitroselulosa dan perawatan diambil untuk
menghapus semua gelembung udara. Sebuah pad dan plastik kedua
jaringan ditambahkan dan karet gelang yang digantung di semua
lapisan. gel demikian tegas dan merata menempel lembar nitroselulosa. -
asumsi yang sembly dimasukkan ke sebuah ruang destaining elektroforesis
dengan lembar nitroselulosa menghadapi katoda. Ruang yang
terkandung 0,7% asam asetat. Sebuah gradien tegangan 6 V / cm itu ap-
menghujani selama 1 jam.
Untuk poliakrilamida elektroforesis di hadapan
natrium dodesil sulfat (13) bukan urea, prosedur itu
seperti dijelaskan di atas kecuali bahwa polaritas
elektroda terbalik dan buffer elektroda adalah 25
mM Tris-192 mM glisin / 20% (vol / vol) metanol pada
pH 8,3. Pewarnaan untuk Protein. blot dapat
diwarnai dengan amido hitam (0,1% di 45% metanol
/ 10% asam asetat) dan destained dengan 90%
metanol / 2% asam asetat (lihat ref. 14).
Imunologi Deteksi Protein pada
nitroselulosa
Bercak elektroforesis (biasanya tidak diwarnai dengan amido hitam) direndam
dalam 3% bovine serum albumin dalam garam (NaCl 0,9% / 10 mM Tris-HCl, pH 7,4)
selama 1 jam pada 40'C jenuh mengikat protein situs tambahan. Mereka dibilas dalam
saline dan diinkubasi dengan antiserum tepat diencerkan dalam 3% bovine serum
albumin dalam garam juga mengandung serum operator dengan konsentrasi dan
spesies seperti yang ditunjukkan dalam legenda. Seprai dicuci dalam garam (sekitar
lima perubahan selama 30 menit, jumlah) dan diinkubasi dengan kedua (indikator)
antibodi yang ditujukan terhadap imunoglobulin dari antiserum pertama. Sebagai
antibodi indikator kami menggunakan '25i-berlabel domba anti-IgG. Ini telah dimurnikan
dengan kromatografi afinitas pada Sepharose- bergerak protein myeloma dan diberi
label oleh versi modifikasi dari metode chloramine T di 0,5 ml dengan 0,5 mg IgG dan 1
mCi dari Na'25I (1 Ci = 3,7 X 1010becquerels) selama 60 detik pada suhu kamar. Aktivitas
spesifik adalah sekitar 1,5 YCI / Ag IgG. 125I-Berlabel IgG terdilusi menjadi 106 cpm / ml
dalam garam yang mengandung 3% bovine serum albumin dan 10% serum kambing,
dan 3 ml larutan ini digunakan untuk selembar nitroselulosa dari 100cm2. Inkubasi adalah
di hadapan 0,01% NaN3 selama 6 jam pada suhu kamar. Bercak elektroforesis dicuci
dalam garam (lima perubahan selama 30 menit, total) and thor- oughly dikeringkan
dengan hair dryer. Bercak terkena Kodak Film R X-Omat selama 6 hari.
 Fluorescein- dan horseradish peroxidase-conjugated kelinci anti-
kambing IgG (Nordic Laboratories, Tilburg, Belanda) yang dilarutkan
sebelum digunakan sesuai dengan petunjuk produsennya ini. antibodi
fluorescein-conjugated digunakan di 01:50 dilusi dalam garam yang
mengandung 3% bovine serum albumin dan 10% serum kelinci. Setelah
inkubasi selama 30 menit pada suhu kamar, bercak dicuci seperti di
atas dan diperiksa atau difoto dengan kamera Polaroid di bawah sinar
UV gelombang panjang melalui filter kuning.
 Persiapan IgG peroksidase-conjugated lobak digunakan pada 1:
2000 pengenceran dalam garam yang mengandung 3% bovine serum
albumin dan 10% serum kelinci. Bercak diinkubasi selama 2 jam pada
suhu kamar dan dicuci seperti dijelaskan di atas. Untuk reaksi warna
(15), bercak direndam dalam larutan 25, .g o-dianisidine per ml / 0,01%
H202 / 10 mM Tris-HCI, pH 7,4. Ini disiapkan baru dari larutan stok dari
1% dianisidine o- (Fluka) dalam metanol dan 0,30% H202. reaksi diakhiri
setelah 20-30 menit dengan mencuci dengan air. Bercak dikeringkan
antara kertas filter. Pengeringan sangat berkurang pewarnaan latar
belakang. Bercak disimpan yang diproteksi dari cahaya.
Hasil : Transfer elektroforesis dari Ribosomal Protein
dari Polyacrylamide Gel untuk nitroselulosa Sheets
Kebanyakan protein atau kompleks yang mengandung teradsorpsi
protein mudah untuk nitroselulosa filter (16), sedangkan garam, banyak
molekul kecil, dan RNA biasanya tidak dipertahankan. Sifat-sifat mengikat
secara luas digunakan untuk mengikat tes dengan filter nitroselulosa. Kami
menemukan bahwa protein dipertahankan pada filter ini sama baiknya
ketika dilakukan terhadap filter dalam medan listrik. Jika medan listrik
adalah tegak lurus terhadap gel slab mengandung protein dipisahkan
(lihat Gambar. 1), kami memperoleh replika dari pola protein pada
lembar trocellulose ni. Hal ini ditunjukkan dengan protein ribosom dari E.
coli; gel konvensional bernoda (Gambar. 2A) dan blot elektroforesis patri
gel yang identik (Gambar. 2B) akan ditampilkan. Semua protein ribosom
dari hati ayam dan E. coli ribosom terdeteksi pada gel dua dimensi dapat
dilihat pada bercak trophoretic pemilu yang dihasilkan dari mereka.
Contoh dari blot dari gel dua dimensi diberikan pada Gambar. 3. Ketika
gel poliakrilamida asli bernoda setelah blotting, tidak ada protein dapat
dideteksi. Dengan demikian, prosedur blotting dihapus semua protein dari
gel.
 Untuk menentukan apakah protein dihapus dari gel kuantitatif
disimpan pada lembar nitroselulosa, kami yang dipisahkan protein 3H-
label dari 60S hati ayam ribosom subunit dengan dua dimensi
elektroforesis dan membandingkan radioaktivitas yang dapat pulih
dari blot dengan yang pulih langsung dari gel (Tabel 1). protein
tunggal atau kelompok protein dipisahkan buruk dipotong dan tivity
radioac- diukur setelah pembakaran sampel. Hasilnya dalam
variabilitas melekat yses anal- dua dimensi. Variasi bisa
dipertanggungjawabkan melalui transfer variabel protein ke dalam gel
dimensi kedua dan ketajaman dengan yang bintik-bintik dapat
dipotong.
 Pada beban melebihi kapasitas nitroselulosa, kerugian dari protein
terjadi. Titrasi dengan protein ribosom radioaktif dalam kondisi blotting
menunjukkan bahwa pada konsentrasi di bawah 0,15, Lg / mm2
semua protein itu terserap. Overloading menjadi jelas ketika lembar
kedua nitroselulosa langsung un- derneath yang pertama mengambil
protein atau ketika protein menjadi terlihat di permukaan cathodal
dari amido bercak hitam bernoda.
 Konservasi resolusi bersama-sama dengan covery re- tinggi protein
ribosom menyederhanakan prosedur untuk toradiography au-.
Prosedur umum melibatkan pengeringan gel poliakrilamida di bawah
panas dan mengurangi tekanan (19), yang membosankan dan
memakan waktu, dapat dihilangkan. Be- menyebabkan protein
menjadi terkonsentrasi pada lapisan yang sangat tipis, autoradiografi
dari 14C- dan M5s-label protein harus sangat efisien bahkan tanpa 2,5-
diphenyloxazole impregnasi (19). Kami telah berhasil memperoleh
autoradiograms tersebut dari gel protein MS-label (tidak ditampilkan).
Selanjutnya, eksperimen awal dengan protein bertanda tritium
menunjukkan bahwa bercak kering dapat diproses untuk fluorography
oleh perendaman singkat di 10% diphenyloxazole dalam eter (20).
 Percobaan di atas dilakukan dengan protein ribosom dipisahkan
pada gel poliakrilamida yang mengandung urea. Kami telah
elektroforesis dihapuskan protein dari natrium dodesil sulfat dengan
prosedur yang dimodifikasi juga dijelaskan dalam Bahan dan Metode.
Sekali lagi, tidak ada kehilangan resolusi. Namun, perbedaan intensitas
pewarnaan antara protein pada gel dan blot yang jelas. Meskipun
pemulihan tampaknya tidak lengkap, bercak dari gel poliakrilamida
yang mengandung sodium dodecyl sulfat dapat digunakan untuk
mendeteksi antigen dengan cara yang sama seperti yang dijelaskan
di bawah ini untuk protein ribosom (un diterbitkan percobaan).
Deteksi Antigen oleh antibodi mengikat pada Blot Dalam
Situ. Kami menemukan bahwa protein ditransfer ke
lembaran nitroselulosa tetap ada tanpa ditukar selama
beberapa hari. Karena blot bisa jenuh dengan albumin
serum sapi untuk memblokir kapasitas mengikat sisa
lembaran, dapat diperlakukan sebagai immunoassay
fase padat. Dalam mengikuti aplikasi munological im-,
kami menggunakan teknik tidak langsung seluruh.
Dengan demikian, antibodi terikat oleh antigen amobil
terdeteksi oleh kedua, antibodi berlabel ditujukan
terhadap antibodi pertama, dan dalam setiap kasus
kelebihan antibodi terikat dicuci.
 Pada Gambar. 4 deteksi E. coli protein ribosom L7 dan L12 dengan serum kambing khusus untuk
protein L7 dan L12 ditunjukkan. L7 identik dengan L12, kecuali untuk NH2-terminal asam amino N-asetat
nya (21). L7 dan L12 sepenuhnya crossreact imunologis (22) dan dipisahkan dari asam gel amida
polyacryl- (21). Kedua peroxidase- (Gambar. 4A) dan terkonjugasi antibodi fluorescein- (Gambar. 4B)
mampu mengungkapkan globulin immuno- yang khusus dipertahankan oleh protein L7 dan L12. Dalam
setiap kasus, gel yang lebih rendah adalah kontrol dengan serum preimmune. antibodi peroksidase-
conjugated jauh lebih sensitif daripada yang fluorescein-terkonjugasi. Mereka bisa karena itu harus
digunakan pada pengenceran yang lebih tinggi. Ini juga diizinkan deteksi jumlah yang sangat kecil
antigen. Dengan serum kelinci (23) kita bisa mendeteksi 100 pg dari L7 dan L12 dengan serum dan inkubasi
ditions con- mirip dengan theexperiment dijelaskan pada Gambar. 4 (tidak ditampilkan).
 Karena kita dapat menggunakan prosedur untuk mendeteksi tubuh anti tertentu
bereaksi dengan protein tertentu setelah elektroforesis di polacrylamide, kami juga harus bisa
menentukan protein telah menimbulkan antibodi dalam campuran kompleks immunogens.
Dalam eksperimen Gambar. 5, sera individu lima tikus diimunisasi dengan ribosom hati ayam
yang diuji. Kami menggunakan 125I-label domba imunoglobulin anti-mouse untuk
mendeteksi keberadaan imunoglobulin tikus. Dalam semua tikus, antibodi yang istimewa
diproduksi terhadap protein perlahan bergerak, mungkin berat molekul tinggi. prosedur
sehingga dapat mencirikan populasi antigen terhadap yang antibodi spesifik telah
dibesarkan dalam campuran immunogens.
Pembahasan

Teknik elektroforesis blotting dijelaskan di sini menghasilkan replika

protein dipisahkan pada gel poliakrilamida dengan kesetiaan yang
tinggi. Kami memperoleh pengalihan kuantitatif dengan protein dari
gel yang mengandung urea. Ini didirikan di sini dengan protein
ribosom. Lebih umum, membran nitroselulosa telah digunakan untuk
mempertahankan protein dari larutan encer untuk penentuan
kuantitatif selanjutnya mereka (16). Namun, tetap ada tanggung-
kemungkinan yang kelas tertentu protein tidak mengikat nitroselulosa.
Dalam hal ini penyerap lembar selain nitroselulosa atau kondisi yang
berbeda-blotting-beda dapat membantu.
 Kami telah menunjukkan bahwa protein bergerak pada lembar
selulosa nitro- dapat digunakan untuk mendeteksi antibodi masing-
masing. Dengan antibodi berlabel radioaktif atau peroksidase-
terkonjugasi metode ini cukup sensitif untuk mendeteksi jumlah kecil
antigen elektroforesis dipisahkan, dan prosedur sederhana ini juga dapat
digunakan untuk menunjukkan adanya sejumlah kecil antibodi dalam
serum titer rendah. Karena antigen yang immo- bilized pada selembar
kertas, antibodi tidak diperlukan untuk membentuk cipitate pra dengan
antigen. Oleh karena itu teknik blotting memiliki potensi untuk analisis
immunoelectrophoretic protein dengan menggunakan mengikat fragmen
Fab atau pengikatan antibodi terhadap penentu tunggal, seperti antibodi
monoklonal yang dihasilkan oleh hibridoma (24). Ini tidak bisa dilakukan
dengan teknik immunoelectrophoretic sewa skr. Jika klon hibridoma
diperoleh dari mouse diimunisasi dengan murni immu- nogen, itu akan
bepossible menggunakan thetechnique toscreen untuk klon membuat
antibodi yang ditujukan terhadap antigen yang diinginkan. Tersedia
antigen yang diinginkan telah mobilitas karakteristik di polyacryl-
elektroforesis amida gel, klon yang sesuai dapat dipilih tanpa harus
antigen murni.
 Teknik ini telah dikembangkan untuk mendeteksi antisera spesifik
terhadap protein ribosom. Namun, itu berlaku untuk setiap prosedur
analitis tergantung pada pembentukan kompleks ligan proteinuria.
Dengan teknik blotting, yang prosedur yang biasa membentuk
kompleks dalam larutan dan menyimpannya pada membran harus
dibalik: protein, sudah diserap ke membran, harus mempertahankan
ligan dari solusi di mana membran direndam. tindakan antar- yang
mungkin dapat dianalisis dengan cara ini termasuk hormonal
Depdiknas-reseptor, siklik AMP-reseptor, dan interaksi asam protein-
nukleat. ligan juga mungkin protein. Enzim yang dipisahkan pada gel
poliakrilamida bisa juga dengan mudah lo- calized pada bercak
dengan di tes in situ. Sebuah persyaratan penting untuk aplikasi ini
adalah bahwa protein yang tidak rusak oleh proses adsorpsi dan
bahwa situs pengikatan tetap dapat diakses oleh ligan dan substrat.
Dalam hal ini, pertimbangan yang sama dengan yang di kromatografi
afinitas dan teknik enzim larut berhubungan.
 Metode ini juga bisa disesuaikan dengan prosedur Cleveland et al.
(28) untuk analisis protein dielusi dari band-band di gel poliakrilamida
dengan sidik jari salah satu dimensi: satu bisa label oleh iodinasi di
situ'on nitroselulosa dan kemudian melaksanakan pencernaan
proteolitik.
Dalam percobaan awal kami telah berusaha untuk
mengidentifikasi ribosom RNA mengikat protein dengan RNA protein
ribosom bergerak di nitroselulosa dengan prosedur makalah ini, diikuti
dengan pewarnaan untuk RNA (data tidak dipublikasikan) yang
mengikat, dan telah menemukan kecenderungan untuk nonspesifik
mengikat. Namun, J. Steinberg, H. Weintraub, dan U. K. Laemmli
(komunikasi yang personal) telah dikembangkan sendiri prosedur yang
sama untuk mengidentifikasi DNA mengikat protein.
TERIMA KASIH :D