Bioenergetika, Oksidasi Biologi

dan Radikal Bebas

Dr. Marhaen Hardjo, M.Biomed, PhD

Bagian Biokimia Fakultas Kedokteran

Universitas Hasanuddin Makassar
 BIOENERGETIKA

MEMPELAJARI DINAMIKA/ PERUBAHAN

ENERGI PADA REAKSI BIOKIMIAWI
(REAKSI KIMIA PADA ORGANISME)
• Bioenergetika dan ATP
• Bioenergetika atau termodinamika biokimia
adalah ilmu pengetahuan mengenai perubahan
energi yang menyertai reaksi biokimia. Sistem
nonbiologik dapat menggunakan energi panas
untuk melangsungkan kerjanya. Sedangkan
sistem biologik bersifat isotermik dan
menggunakan energi kimia untuk memberikan
tenaga bagi proses kehidupan.

3
• Kaidah termodinamika dalam sistem biologik
• Kaidah pertama termodinamika:
• Kaidah pertama ini merupakan hukum penyimpanan
energi, yang berbunyi: energi total sebuah sistem,
termasuk energi sekitarnya adalah konstan. Ini
berarti bahwa saat terjadi perubahan di dalam sistem
tidak ada energi yang hilang atau diperoleh. Namun
energi dapat dialihkan antar bagian sistem atau dapat
diubah menjadi energi bentuk lain. Contohnya energi
kimia dapat diubah menjadi energi listrik, panas,
mekanik dan sebagainya
• Kaidah kedua termodinamika:
• Kaidah kedua berbunyi: entropi total sebuah sistem
harus meningkat bila proses ingin berlangsung
spontan. Entropi adalah derajat ketidakteraturan atau
keteracakan sistem. Entropi akan mencapai taraf maksimal
di dalam sistem seiring sistem mendekati keadaan
seimbang yang sejati. Dalam kondisi suhu dan tekanan
konstan, hubungan antara perubahan energi bebas (ΔG)
pada sebuah sistem yang bereaksi, dengan perubahan
entropi (ΔS), diungkapkan dalam persamaan:
• ΔG = ΔH – TΔS
• Keterangan: ΔH adalah perubahan entalpi (panas) dan T
adalah suhu absolut.
• Di dalam kondisi reaksi biokimia, mengingat ΔH kurang
lebih sama dengan ΔE, perubahan total energi internal di
dalam reaksi, hubungan di atas dapat diungkapkan dengan
persamaan:
• ΔG = ΔE – TΔS
• Jika ΔG bertanda negatif, reaksi berlangsung spontan
dengan kehilangan energi bebas (reaksi eksergonik). Jika
ΔG sangat besar, reaksi benar-benar berlangsung sampai
selesai dan tidak bisa membalik (irreversibel).
• Jika ΔG bertanda positif, reaksi berlangsung hanya jika
memperoleh energi bebas (reaksi endergonik). Bila ΔG
sangat besar, sistem akan stabil tanpa kecenderungan untuk
terjadi reaksi.
• PADA ILMU KIMIA TELAH DIKENAL ADANYA:
 1.REAKSI ENDOTERMIS: REAKSI YG MEMERLUKAN
PANAS
 2.REAKSI EKSOTERMIS: REAKSI YG
MENGHASILKAN PANAS

PADA SISTEM NON BIOLOGIS ENERGI PANAS DAPAT

DIUBAH MENJADI ENERGI MEKANIS ATAU ENERGI
LISTRIK
• PADA SISTEM BIOLOGIS:
• MANUSIA BERSIFAT ISOTERMIS (SUHU TUBUH
KONSTAN).
• MANUSIA MENGGUNAKAN PANAS YANG
TERBENTUK PADA SUATU REAKSI ANTARA LAIN
UNTUK MEMPERTAHANKAN SUHU TUBUH TETAPI
TIDAK DAPAT MENGUBAHNYA MENJADI ENERGI
MEKANIK ATAU ENERGI LISTRIK, SISA PANAS
AKAN DIBUANG KE LUAR. OLEH KARENA ITU
YANG LEBIH PENTING DIPERHITUNGKAN ADALAH
BENTUK ENERGI KIMIA (ATP DLL)
• PADA SISTEM BIOLOGIS PROSES YG MEMERLUKAN
ENERGI MENDAPATKANNYA DENGAN CARA
MENGAITKAN REAKSI YG PERLU ENERGI (REAKSI
ENDERGONIK) DENGAN DENGAN REAKSI YANG
MENGHASILKAN ENERGI (REAKSI EKSERGONIK)

• R. EKSERGONIK 1   PROSES SINTESIS

2 ~E  KONTRAKSI OTOT
3 PENGHANTARAN SARAF
4 TRANSPOR AKTIF
 Panas
Eksergonik

Energi E
kimia
End
Eks ~E
Endergonik
• MEKANISME PENGAITAN:
 1. MELALUI PEMBENTUKAN SENYAWA ANTARA:
A + C  | SA |  B + D
 2. MELALUI PEMBENTUKAN SENYAWA KAYA ENERGI (~ E )
AD2:
CARA: SUATU SENYAWA (E) AKAN MENANGKAP ENERGI YG
DIHASILKAN OLEH REAKSI EKSERGONIK  ~E, DAN KEMUDIAN
~E AKAN MEMBERIKAN ENERGINYA UNTUK REAKSI ENDERGONIK
~ ADALAH SIMBOL UNTUK MENUNJUKKAN IKATAN BERENERGI
TINGGI

• SENYAWA KAYA ENERGI (~ E ) YG PALING BANYAK DIDAPAT

ADALAH ATP: ADENOSIN – P ~ P ~ P
 SENYAWA KAYA ENERGI (~E)

• ATP: ADENOSIN – P ~ P ~ P (ADENOSIN TRIFOSFAT)

 ATP ADALAH SUATU NUKLEOTIDA YG DALAM
BENTUK AKTIFNYA MEMBENTUK KOMPLEKS
DENGAN Mg++ ATAU Mn++
 PERANAN ATP SBG PEMBAWA ENERGI TERLETAK
PADA GUGUSAN TRIFOSFAT YG MENGANDUNG 2
IKATAN FOSFOANHIDRID. HIDROLISIS IKATAN INI
AKAN MELEPASKAN BANYAK ENERGI BEBAS.
 ANALOG ATP : GTP, CTP, UTP
• SENYAWA KAYA ENERGI (~ E ) LAINNYA
MISALNYA FOSFOENOLPIRUVAT,
KREATINFOSFAT ( ADA SIMBOL IKATAN
BERTENAGA TINGGI (~)>otot jantung.

• TUMBUHAN MENDAPATKAN ENERGINYA DARI

FOTOSINTESIS SEDANGKAN HEWAN DAN
MANUSIA MENDAPATKANNYA DARI BAHAN
MAKANAN
 PERUBAHAN ENERGI BEBAS

• PADA REAKSI A + B ==== C + D

SECARA TERMODINAMIKA:
APABILA Δ G < 0  DIKATAKAN REAKSI KE
KANAN BERSIFAT EKSERGONIK (DAPAT
BERLANGSUNG SPONTAN)
APABILA Δ G = 0  DIKATAKAN REAKSI
SETIMBANG
APABILA Δ G > 0  DIKATAKAN REAKSI KE
KANAN BERSIFAT ENDERGONIK (TIDAK
DAPAT BERLANGSUNG SPONTAN, KARENA
UNTUK DAPAT BERLANGSUNG PERLU ENERGI/
DIKAITKAN DGN REAKSI EKSERGONIK)
• REAKSI BIOKIMIA DI DALAM SEL UMUMNYA TAK
DAPAT BERLANGSUNG DGN SENDIRINYA OLEH
KARENA ADANYA HAMBATAN ENERGI (ENERGY
BARRIER)  JADI PERLU ENZIM UNTUK MENGATASI
HAMBATAN ENERGI INI ( ENZIM MENURUNKAN
ENERGI AKTIVASI , TETAPI TIDAK MENGUBAH HARGA
ΔG )
 SKEMA

kead. transisi

G E. level tanpa katalisator

Ea
=

dgn katalisator inorg

E. bebas
Ea'
dgn enzim

Ea''
kead. awal G = Perubahan
E. bebas

kead. akhir

Perjalanan
reaksi
Biologic oxidation

18
 O2
H 2O
Carbohydrate,
CO2
lipid, etc

mitochondrion ATP

enzymes
19
The concept of the biological
oxidation

20
 Definisi
• Oksidasi = pengurangan elektron / ion H+
• Reduksi = penambahan elektron / ion H+

• Contoh oksidasi:
e
Fe2+ Fe3+

• Tujuan OB: untuk menghasilkan energi

21
 Enzim Oksidoreduktase
• Adalah sekelompok enzim yang terlibat dalam
reaksi reduksi-oksidasi
• Terdiri dari :
1. Oksidase
2. Dehidrogenase
3. Hidroperoksidase
4. Oksigenase

22
 1. Oksidase

• Mengkatalisis pengeluaran hidrogen dari substrat

dgn menggunakan oksigen sebagai akseptor
hidrogen.

• Enzim-enzim tsb membentuk;

- air (H2O)
- hidrogenperoksida (H2O2)

23
 Enzim Oksidase

AH2 ½ O2 AH2 O2

Oksidase

A H2O A H2O2

(1) Air (2) Hidrogenperoksida

24
 Enzim Oksidase

1. Sitokrom oksidase

2. Oksidase dgn flavoprotein;

- Asam L-amino oksidase
- Xantin oksidase
- Glukosa oksidase
- Aldehid dehidrogenase

25
 Sitokrom Oksidase

• Adalah hemoprotein dengan gugus prostetik

heme : pembentukan hidrolisis dalam darah
• Enzim ini dapat dirusak oleh:
- karbonmonoksida
- sianida (paling keras)
- hidrogen sulfida (H2S)

26
 Flavoprotein

• Kelompok enzim ini memiliki gugus prostetik

flavin mononukleotida (FMN) atau flavin
adenin dinukleotida (FAD).

• Gugus prostetik tsb dibentuk dari riboflavin.

27
 2. Dehidrogenase
Memiliki 2 fungsi utama:
1. - Memindahkan H dlm reaksi redoks.
- Sering memakai koenzim NAD+/NADP+
yg membutuhkan niasin.
2. - Sebagai komponen rantai respirasi.

28
 Rangkaian Reaksi Dehidrogenase
AH2 Pembawa BH2
(red) (oks) (red)

A Pembawa-H2 B
(oks) (red) (oks)

A B
dehidrogenase dehidrogenase
29
 3. Hidroperoksidase
• Kelompok enzim ini melindungi tubuh
terhadap peroksida,
• Karena akumulasi peroksida dapat
mencetuskan radikal bebas yg merusak
membran sel.
• Terdiri dari 2 macam enzim:
1. Peroksidase
2. Katalase
30
 Peroksidase

• Banyak terdapat dalam susu, leukosit, platelet,

dan jaringan lain yg terlibat dalam metabolisme
eikosanoid.

• Hidrogen peroksida direduksi dengan

mengorbankan substansi seperti; askorbat,
kuinon, & sitokrom C.

31
 Peroksidase
H2O2 + AH2 2H2O + A

32
 Peroksidase

Glutation peroksidase dgn gugus

prostetik selenium bekerjasama dengan
glutation tereduksi melindungi
membran lipid & hemoglobin terhadap
oksidasi oleh senyawa peroksida.

33
 Katalase

• Enzim ini banyak terdapat dalam;

darah, sumsum tulang, membran mukosa,
ginjal, dan hepar.
• Berfungsi menghancurkan H2O2 yang
terbentuk oleh kerja oksidase.
• Katalase & oksidase ini terdapat di dalam
peroksisom.

34
 Katalase & Oksidase
A’H2 A’
AH2 A

O2 H2O2 Katalase 2H2O

Oksidase

H2O2 O2

35
 4. Oksigenase

• Enzim dalam kelompok ini mengkatalisis

pemindahan & inkorporasi (penyatuan) oksigen
ke dalam molekul substrat.
• Terdiri dari:
- Dioksigenase
- Monooksigenase

36
 Dioksigenase

• Penyatuan molekul O2 ke substrat.

• Terdiri dari:
1. Enzim yg mengandung Fe, seperti;
- homogentisat dioksigenase
2. Enzim yg menggunakan heme, seperti;
L-triptofan dioksigenase (triptofan
pirolase) dalam hepar

37
 Monooksigenase

• Penyatuan hanya satu atom molekul O ke

dalam substrat.

• Atom O lainnya direduksi menjadi air.

38
 Monooksigenase Sitokrom P450

• Enzim ini terdapat dalam mikrosom sel hepar.

• Membutuhkan NADH & NADPH untuk
dioksidasi dalam reaksi yang disebut siklus
hidroksilase.
• Penting untuk hidroksilasi obat-obatan

39
 Organisme Autotrofik

• Artinya memberi makan diri sendiri.

• Organisme ini memperoleh pasokan energi
bebas melalui perangkaian metabolisme- nya
dgn proses eksergonik sederhana tertentu
dalam lingkungan sekitarnya.
• Contoh;
Tumbuhan hijau menggunakan energi dari
cahaya matahari untuk fotosintesis.

40
 Organisme Heterotrofik

• Artinya tidak mencukupi diri sendiri.

• Adalah organisme yang memperoleh pasokan
energi bebas melalui perangkaian
metabolismenya dgn pemecahan molekul
organik komplek dalam lingkungannya.
• Pada proses ini, ATP (Adenosin Trifosfat)
berperan dalam pemindahan energi bebas dari
proses eksergonik kepada proses endergonik.

41
 Adenosin Trifosfat (ATP)

• Adalah nukleotida trifosfat yg mengandung

adenin, ribosa, & 3 gugus fosfat.
• Agar dapat bekerja, ATP membentuk komplek
Mg2+.
• ATP mengandung 2 gugus fosfat-berenergi
tinggi & sebuah fosfat berenergi-rendah (ikatan
ester biasa).
• Gugus fosfat berenergi-tinggi dilambang-kan
sebagai P
42
 Adenosin Trifosfat (ATP)
NH2
N N

N
Mg2+ N

O- O- O-

-O P O P O P O CH O

O O O

43
OH OH
 Metabolisme

• Reaksi katabolisme (eksergonik) ialah;

Pemecahan atau oksidasi molekul bahan
bakar.

• Reaksi anabolisme (endergonik) ialah;

Reaksi sintesis berbagai substansi.

• Jadi, Metabolisme ialah;

Kombinasi proses katabolik dan anabolik.
44
 Metabolisme

Suatu proses endergonik tidak dapat berjalan

sendiri,

tetapi harus menjadi komponen suatu sistem

eksergonik-endergonik yg berpasangan,

sehingga keseluruhan perubahan bersih (netto)

bersifat eksergonik.
45
 Siklus ATP/ADP

• Berperan untuk menghubungkan proses-proses

yg menghasilkan P-berenergi-tinggi dgn proses
yg menggunakan P-berenergi-tinggi.
• ATP dikonsumsi & dibentuk kembali secara
kontinu.
• Depot ATP/ADP sangat kecil, sehingga hanya
cukup untuk mempertahankan jaringan aktif
dlm waktu beberapa detik saja.

46
 Siklus ATP/ADP

ATP
CO2

Pernapasan: Penggunaan energi:

pembentukan energi - biosintesis makro-
dari; - karbohidrat molekul
- lemak - kontraksi otot
- protein - transpor ion aktif
- termogenesis

O2
ADP + Pi
47
 Sumber Utama P-berenergi-tinggi

1. Fosforilasi oksidasi;
-Sumber P terbesar dlm organisme aerobik.
-Energi bebasnya berasal dari oksidasi rantai
respirasi.
2. Glikolisis;
-Pembentukan dua P dari hasil katalisis
fosfogliserat kinase & piruvat kinase.
3. Daur Krebs;
-Satu P-berenergi-tinggi dibentuk pada tahap
suksinil tiokinase.
48
 Peran Rantai Respirasi

asam lemak
+ b-oksidasi
gliserol ATP
O2

glukosa Asetil KoA SAS 2H H2O

rantai respirasi
Asam amino ADP

mitokondria

49
50
 Rantai Respirasi

• Penyedia sebagian besar energi untuk

metabolisme melalui fosforilasi oksidatif.
• Komponen rantai respirasi tersusun dari
potensial redok lebih negatif ke komponen
dengan potensial redoks yg lebih positif.
• Jalur ini mengumpulkan & mengoksidasi
sejumlah ekuivalen pereduksi (-H atau e) yang
dihasilkan dari oksidasi karbohidrat, asam
lemak, & protein.
51
52
 Produk ATP pada Fosforilasi Oksidatif

Berdasarkan hipotesis kimiosmotik dari Mitchell

yaitu;
rantai bekerja --> proton dipompa keluar dari
membran dlm mitokondria --> pH antar
membran turun --> proton balik ke dalam matrik
lewat tonjolan ATP-sintase--> fosforilasi ADP
menjadi ATP.

53
 Produk ATP pada Fosforilasi Oksidatif

• Diperkirakan satu ATP disintesis setiap dua

proton melewati tonjolan tsb.
• Hasilnya ialah;
- 3 mol. ATP utk oksidasi 1 mol. NADH
- 2 mol. ATP utk oksidasi 1 mol. FADH2
• Laju fosforilasi oksidatif dikendalikan oleh;
NADH, oksigen, ADP

54
ATP Sintase

55
 Kepustakaan

• Marks, DB., Marks, AD., Smith CM. Basic medical

biochemistry: a clinical approach. 1996. Dalam: B.U. Pendit,
penerjemah. Biokimia Kedokteran Dasar: Sebuah Pendekatan
Klinis. Eds. J. Suyono., V. Sadikin., L.I. Mandera. Jakarta:
EGC, 2000

• R.K. Murray, D.K. Granner, P.A. Mayes, V.W. Rodwell

Harper’s Biochemistry. 27th ed. McGraw-Hill Companies,
New York. 2006.

56
 The three stages of
biological oxidation

57
 Nutriment materials

Building block molecules

Stage 1

Acetyl coenzyme A
Stage 2

tricarboxylic acid cycle

Stage 3

Oxidative phosphorylation 58
59
Mitochondrion oxidation
system

60
 metabolism
Carbohydrate, lipid, H2O, CO2
proteins

FADH, NADH
H2O,
Mitochondrial oxidation
system
energy 61
 the structure of
mitochondrion
Out membrane

Inner membrane

matrix 62
63
 ATP synthase

F0-F1 complex

a large membrane –protein

complex

64
65
 respiratory chain

1. concept

2. constitutes

four electron-carrier
complexes 66
67
3. types
NADH oxidation
respiratory chain

Succinate oxidation

respiratory chain
68
 4. The components & function
of the each electron-carrier
complexes in these two

respiratory chain

. A. complex Ⅰ ( NADH-Q reductase)

69
70
* Riboflavin proteins

structure
function
types

71
72
73
* iron-sulfur proteins

structure

function

74
75
 2 3
Fe  Fe

76
* ubiquinone,Q (coenzyme Q)

structure

function

77
78
79
B. complex Ⅱ ( succinic-Q reductase )

Fe-s
AH2 FAD Q
reduced

A Fe-S
FADH2
QH2
oxidized

80
81
 C. complex Ⅲ
(Q-CytC reductase )
Contain:
cytb562 C
cytb
cytc
cytb566 C1

iron-sulfur proteins
82
* cytochromes, ( cyt )

a. structure

83
84
 b. Classification:
cytb562
cycb
cytb566
C
cytc
C1
a
cyta
a3 85
c. the differences between
each cytochromes

the side chain

linkage with apoenzyme

Light –absorption spectra86
d. function

Single electron carriers

iron in protoporphyrin
prosthetic group
87
88
 2 3
Fe  Fe

89
D. complexⅣ
(CytC oxidase )

Contain:

cyta,a3

CuA,CuB
90
91
5. The orders of these
complexes in the respiratory
chain

A.
A. NADH oxidation

respiratory chain 92
 • Compose of complex
Ⅰ, Ⅲ, Ⅳ

a. contain : +
NAD ,FMN(Fe-S),
CoQ,Cytb, c1,c ,
aa3,Cu,O2
93
b. order

94
95
96
B. Succinate oxidation
respiratory chain

• Compose of complex
Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ

97
a. contain :
FAD+ (Fe-S), CoQ,
Cytb, c1,c ,
aa3,Cu, O2

98
b. order

99
C. the evidences of the
arrangement order

• redox potential
• light absorption spectra
• inhibitors
100
101
102
• gentle treatment with
detergents

CoQ linked with

complex Ⅰ ,Ⅱ, Ⅲ
cytc linked with
complex Ⅲ, Ⅳ 103
104
6. the process of the electron
transportation

105
106
Oxidative phosphorylation

A. concept

107
Metabolic oxidized
materials products
Respiratory chain
2H +1/2 O2 H2O

energy

ADP  H 3 PO4  ATP  H 2 O

108
B. coupling sites of Oxidative
phosphorylation

109
a. the methods for
estimate of the coupling
sites

• the p/o ratio

110
111
• calculation formula
of free energy change

(standard reduction potential , E0’)

ΔG0’= -nFΔE0’
112
example:
electrons pass from NADH（E0’=-0.32v ）
to O2(E0’=+0.82v)
ΔG0’= -296.6[0.82-(-0.32)]= -220 KJ
NADH Q ΔG0’= -69.4 KJ
CytB CytC ΔG0’= -34.7 KJ
Cytaa3 O2 ΔG0’= - 102.3 KJ

113
114
C. The mechanism of Oxidative
phosphorylation

• The chemiosmotic hypothesis

115
116
D. factors effecting on oxidative
phosphorylation

• ADP/ATP

• Thyroid hormone

117
 E. inhibitors of oxidative

phosphorylation

• inhibitors of respiratory chain

• uncoupler (2,4dinitrophenol)

• inhibitors of oxidative
phosphorylation (oligomycin)118
119
120
121
The storage,release,& utilization
of ATP

A. the sources of high energy

phosphate group in ATP

122
 • oxidative phosphorylation

• phosphorylation on substrate level

123
example：
1,3-diphosphoglycerate + ADP phosphoglycerate + ATP

PEP + ADP EP + ATP

PK

succinylCoA + H3PO4 + GDP succinate+ CoA-SH

+
GTP
+
ADP

ATP
124
B. the storage of ATP

• phosphocreatin

125
C . the other nucleoside
triphosphates

126
Electrons from cytosolic NADH
enter mitochondrial by shuttles

• glycerol phosphate shuttle

• Malate-asparate shuttle

127
RADIKAL BEBAS

128
 Reactive Oxygen
Species
I. Free radicals & ROS Defined
II. Sources of ROS
III. Oxidative damage in biological systems
IV. Antioxidant Defense
V. ROS signaling and redox sensitive pathways
VI. Oxidative stress and disease
VII. Detection methods for ROS & oxidative stress
 I. Free Radicals & ROS Defined

• The Earth was originally anoxic

• Metabolism was anaerobic
• O2 started appearing ~2.5 x 109 years ago

Anaerobic metabolism-glycolysis
Glucose + 2ADP + 2Pi Lactate + 2ATP + 2H2O

O2 an electron acceptor in aerobic metabolism

Glucose + 6O2 + 36ADP + 36Pi 6CO2 + 36ATP + 6H2O
• Ground-state oxygen has 2-unpaired electrons

: :
: :
. O:O .

• The unpaired electrons have parallel spins

• Oxygen molecule is minimally reactive

due to spin restrictions
 Basics of Redox Chemistry
Term Definition

Oxidation Gain in oxygen

Loss of hydrogen
Loss of electrons

Reduction Loss of oxygen

Gain of hydrogen
Gain of electrons

Oxidant Oxidizes another chemical by taking

electrons, hydrogen, or by adding oxygen

Reductant Reduces another chemical by supplying

electrons, hydrogen, or by removing oxygen
 Prooxidants
Free Radicals: R3C. Carbon-centered
 Any species capable of independent
existence that contains one or more R3N. Nitrogen-centered
unpaired electrons R-O. Oxygen-centered
 A molecule with an unpaired electron
in an outer valence shell R-S. Sulfur-centered

H2O2 Hydrogen peroxide

Non-Radicals:
 Species that have strong oxidizing HOCl- Hypochlorous acid
potential O3 Ozone
 Species that favor the formation of
1O Singlet oxygen
strong oxidants (e.g., transition 2
metals) ONOO- Peroxynitrite
Men+ Transition metals
 Reactive Oxygen Species (ROS)
Radicals: Non-Radicals:
O2.- Superoxide H2O2 Hydrogen peroxide
OH. Hydroxyl HOCl- Hypochlorous acid
RO2. Peroxyl O3 Ozone
1O Singlet oxygen
RO. Alkoxyl 2

HO2. Hydroperoxyl ONOO- Peroxynitrite

Reactive Nitrogen Species (RNS)

Non-Radicals:
ONOO- Peroxynitrite
ROONO Alkyl peroxynitrites
Radicals: N2O3 Dinitrogen trioxide
N2O4 Dinitrogen tetroxide
NO. Nitric Oxide HNO2 Nitrous acid
NO2. Nitrogen dioxide NO2+ Nitronium anion
NO- Nitroxyl anion
NO+ Nitrosyl cation
NO2Cl Nitryl chloride
 “Longevity” of reactive species
Reactive Species Half-life

Hydrogen peroxide
Organic hydroperoxides ~ minutes
Hypohalous acids

Peroxyl radicals ~ seconds

Nitric oxide

Peroxynitrite ~ milliseconds

Superoxide anion
Singlet oxygen ~ microsecond
Alcoxyl radicals

Hydroxyl radical ~ nanosecond

 Oxidative Stress

Antioxidants

Prooxidants

“An imbalance favoring prooxidants and/or disfavoring

antioxidants, potentially leading to damage” -H. Sies
 Radical-mediated reactions
Addition
R. + H2C=CH2 R-CH2-CH2.

Hydrogen abstraction
R. + LH RH + L.

Electron abstraction
R. + ArNH2 R- + ArNH2.+

Termination
R. + Y. R-Y

Disproportionation
CH3CH2. + CH3CH2. CH3CH3 + CH2=CH2
 Hydroxyl radical (.OH)

O2.- + Fe3+ O2 + Fe2+ (ferrous)

Fenton H2O2 + Fe2+ OH- + .OH + Fe3+ (ferric)
Haber-Weiss O2.- + H2O2 OH- + O2 + .OH

•Transition metal catalyzed

•Other reductants can make Fe2+ (e.g., GSH, ascorbate, hydroquinones)
•Fe2+ is an extremely reactive oxidant
Important Enzyme-Catalyzed Reactions
 Biological Pathways for Oxygen Reduction

From: McMurry and Castellion “Fundamentals of general, organic and biological chemistry”
 II. Sources of ROS
Endogenous sources of ROS and RNS
Microsomal Oxidation,
Flavoproteins, Myeloperoxidase
CYP enzymes (phagocytes)

Xanthine Oxidase,
NOS isoforms Endoplasmic Reticulum Transition
metals
Cytoplasm Lysosomes
Fe
Cu

Oxidases, Peroxisomes
Flavoproteins Mitochondria

Plasma Membrane
Lipoxygenases,
Electron transport
Prostaglandin synthase
NADPH oxidase
 Mitochondria as a source of ROS
Mitochondrial electron chain

Localization of the main mitochondrial sources

of superoxide anion

Quinone cycle

Turrens, J Physiol, 2003

Chandel & Budinger, Free Radical Biol Med, 2007

Peroxisomes as a source of ROS and RNS
Fatty Acid
Fatty acyl-CoA
synthetase
Acyl-CoA
Acyl-CoA oxidase H2O2
Enoyl-CoA
Enoyl-CoA hydrolase
Hydroxyacyl-CoA
Hydroxyacyl-CoA
dehydrogenase
Ketoacyl-CoA
Thiolase
Acetyl-CoA Acyl-CoA shortened
by two carbons

Enzymes in mammalian peroxisomes that generate ROS

Schader & Fahimi, Histochem Cell Biol, 2004

 NADPH oxidase as a source of ROS
Present mainly in neutrophils (oxidative burst), but also in many other cell types

ANTIOXIDANTS & REDOX SIGNALING

Volume 8, Numbers 3 & 4, 2006

Activation of the gp91phox (NOX2) containing NOX complex of phagocytes involves phosphorylation of the
cytoplasmic regulator p47phox, with the translocation of the cytoplasmic p47phox, p67phox, and p40phox
regulatory components to the plasma membrane to interact with flavocytochrome-b558, which is composed of
gp91phox and p22phox. Activation of the complex also involves guanine nucleotide exchange on the GTP-binding
protein RAC stimulated by guanine nucleotide exchange factors. Guanine nucleotide exchange on RAC is associated
with release of RhoGDI and translocation of RAC from the cytosol to the NOX complex at the plasma membrane.
Prostaglandin H Synthase (PHS) as a source of ROS
Co-oxidation of xenobiotics (X) during
arachidonic acid metabolism to PGH2

PHS
 Cytoplasmic sources of ROS and RNS

xanthine oxidase xanthine oxidase

Nitric Oxide Synthases (NOS):

neuronal nNOS (I) NO•
endothelial eNOS (III)
inducible iNOS (II)
Lysosome as a source of ROS and RNS

Myeloperoxidase undergoes a complex

array of redox transformations and
produces HOCl, degrades H2O2 to oxygen
and water, converts tyrosine and other
phenols and anilines to free radicals, and
hydroxylates aromatic substrates via a
cytochrome P450-like activity
 Microsomes as a source of ROS (I)

A scheme of the catalytic cycle of cytochrome P450-containing monooxygenases. The binding of the substrate (RH) to ferric P450
(a) results in the formation of the substrate complex (b). The ferric P450 then accepts the first electron from CPR (cytochrome P450
reductase), thereby being reduced to the ferrous intermediate (c). This intermediate then binds an oxygen molecule to form
oxycomplex (d), which is further reduced to give peroxycomplex (e). The input of protons to this intermediate can result in the
heterolytic cleavage of the O–O bond, producing H2O and the ‘oxenoid’ complex (f), the latter of which then inserts the heme-bound
activated oxygen atom into the substrate molecule to produce ROH. In eukaryotic monooxygenases, reactive oxygen species (ROS)
are produced by ‘leaky’ branches (red arrows). In one such branch, a superoxide anion radical is released owing to the decay of the
one-electron-reduced ternary complex (d). The second ROS-producing branch is the protonation of the peroxycytochrome P450 (e),
which forms of H2O2. In addition to these ROS-producing branches, another mechanism of electron leakage appears to be the four-
electron reduction of the oxygen molecule with the production of water (Davydov, Trends Biochem Sci, 2001).
Microsomes as a source of ROS (II)

Davydov, Trends Biochem Sci, 2001

 Exogenous sources of free radicals

• Radiation
UV light, x-rays, gamma rays
• Chemicals that react to form peroxides
Ozone and singlet oxygen
• Chemicals that promote superoxide formation
Quinones, nitroaromatics, bipyrimidiulium herbicides
• Chemicals that are metabolized to radicals
e.g., polyhalogenated alkanes, phenols, aminophenols
• Chemicals that release iron
ferritin
 UV radiation
UVA = 320-400 nm
UVB UVB = 290-320 nm
H2O2 OH. + OH. UVC = 100-290 nm

• Primarily a concern in skin and eye

• Can also cause DNA damage
• Can form singlet oxygen in presence of a sensitizer

Ionizing radiation
g-rays
2H2O H2O + e- + H2O*

H2O* H + .OH
•High energy radiation will result in .OH
Quinone redox cycling as a mechanism to generate ROS

“Premarin (Wyeth–Ayerst) is the most common drug

used for hormone replacement therapy (HRT) and is
composed of approximately 50% estrogens and 40%
equine estrogens [equilenin (EN) and equilin (EQ)] (9).
In vitro experiments have shown that equine estrogens
are successively metabolized and are capable of
forming various types of DNA damage (9–11) (Figure
1). Like estrogen, EN and EQ are metabolized by
cytochrome P450 enzymes (CYP) to their 4-hydroxy
and 2-hydroxy forms (9,10). 4-Hydroxyequilenin (4-
OHEN) is rapidly auto-oxidized to an o-quinone (4-
OHEN-o-quinone) which in turn readily reacts with
DNA, resulting in the formation of unique dC, dA and
dG adducts (4-OHEN–DNA adducts) with four possible
stereoisomers for each base adduct (9,11,12). 4-
Hydroxyequilin (4-OHEQ) is also autoxidized to an o-
quinone which isomerizes to 4-OHEN-o-quinone. As a
result, 4-OHEQ and 4-OHEN produce the same 4-
OHEN–DNA adduct (13). Simultaneously, oxidative
DNA damage, such as 7,8-dihydro-8-oxodeoxyguanine
(8-oxodG), is also generated by reactive oxygen species
through redox cycling between the o-quinone of 4-
OHEN and its semiquinone radicals (14).”

Nucl. Acids Res. (210) 38 (12):e133

 Chemicals that form peroxides
O
O O

O3 + C C C C
Ozone

O O
1O
2 + C C C C
Singlet oxygen
 Chemicals that promote O2.- formation

NAD(P)H NAD(P)+

Flavoprotein

H3C N+ . CH3
H3C N+ N+ CH3 N

Paraquat
Paraquat
radical
cation

O2.- O2
Chemicals that are metabolized to radicals
Polyhalogenated alkanes
Phenols, aminophenols
Chemicals that are metabolized to radicals
 Chemicals that release iron

+ e-
Ferretin Fe2+ Fenton Chemistry

•Requires reductant
•Promotes .OH formation
•Promotes lipid peroxidation in vitro
 III. Oxidative Damage in Biological Systems

Oxidative stress and cell damage

• High doses:
directly damage/kill cells

• Low doses/chronic overproduction of oxidants:

activation of cellular pathways
stimulation of cell proliferation
damage to cellular proteins, DNA and lipids
 Classic lipid peroxidation
1. Initiation
LH + X• L• + XH
2. Propagation
L• + O2 LOO•
LOO• + LH L• + LOOH
3. Termination
2 LOO• non-radical products
L• + LOO• non-radical products
L• + L• non-radical products

Catalyzed by metals
LOOH + Fe2+ OH- + LO. + Fe3+
 Consequences of lipid peroxidation
• Structural changes in membranes
alter fluidity and channels
alter membrane-bound signaling proteins
increases ion permeability
• Lipid peroxidation products form adducts/crosslinks
with non lipids
e.g., proteins and DNA
• Cause direct toxicity of lipid peroxidation products
e.g., 4-hydroxynonenal toxicity
• Disruptions in membrane-dependent signaling
• DNA damage and mutagenesis
 Protein targets for ROS
NH2 H NH2
HS CH2CHCOOH H3C S CH2CH2 C COOH HO CH2CHCOOH

NH2
Cysteine Methionine Tyrosine

Oxidized proteins and amino acids found in biological systems

N NH2

CH2CHCOOH
HN

Histidine

NH2

HN CH2CHCOOH

Tryptophan
Consequences of protein thiol oxidation

Oxidation of catalytic sites on proteins

loss of function/abnormal function
BUT(!): sometimes it is gain in function!
Formation of mixed sulfide bonds
Protein-protein linkages (RS-SR)
Protein-GSH linkages (RS-SG)
Alteration in 2o and 3o structure
Increased susceptibility to proteolysis
 DNA oxidation products
O NH2 NH2

N N N
HN N N
OH OH OH

N N N HO N N
H2N N
H
R R R

8-hydroxyguanine 8-hydroxyadenine 2-hydroxyadenine

O O
NH2
CH3 CH2OH
H
HN OH N
N OH

OH OH
O N
O N H O H
H H
5,8-dihydroxycytosine thymidine glycol 5-hydroxymethyluracil
 Oxidation of deoxyribose (DNA backbone)
O B O B B
O O O
O
. .
H
. O O O
R Strand
O P OR O P OR O P OR
Breaks
O- O- O-

O2

O
O O B B
O O
. OO O
O +B +
O
O P OR O P OR
.O O
O
O- O-

Apurinic/apyriminic sites Aldehyde products

Consequences of DNA oxidation

• DNA adducts/AP sites/Strand breaks

mutations
initiation of cancer
• Stimulation of DNA repair
can deplete energy reserves (PARP)
imbalanced induction of DNA repair enzymes
induction of error prone polymerases
activation of other signaling pathways