KELOMPOK 6

DIV Semester IV

Augustine
Firdausika F Dewi Bintang Fadillah Hanum Heni Suzana E

P3.73.34.2.17.010 P3.73.34.2.17.011 P3.73.34.2.17.017 P3.73.34.2.17.023

TOXOPLASMA IgG dan IgM

Rubella IgG
 Tes ELISA untuk Mendeteksi Antibodi
IgG Terhadap Toxoplasma gondii pada
Serum Menusia
 Toxo IgG
test ELISA untuk mendeteksi antibodi Toxoplasma gondii IgG di serum manusia

Tujuan Penggunaan

ELISA Toxo IgG diperuntukkan untuk mendeteksi antibodi kelas Immunoglobulin G (IgG)
Toxoplasma gondii dalam serum manusia
Toxoplasma menginfeksi hampir semua mamalia dan burung yang merupakan distribusi
terluas dari semua parasit intraseluler. Manusia menjadi terinfeksi melalui kontaminasi
dengan feses atau daging yang tidak dimasak atau memalui penularan langsung melalui
transfusi darah atau penularan bawaan.

Wanita hamil yang memperoleh toxoplasmosis selama trisemester pertama memiliki 25%
resiko penularan janin yang mengakibatkan aborsi spontan, lahir mati atau penyakit
berat. 65% bayi yang lahir dari wanita yang terinfeksi selama trisemester ketiga memiliki
infeksi subklinis yang akhirnya 85% mengalami perkembangan chorioretinitis atau
neurological sequelae.
Prinsip

HUMAN TOXO IgG ELISA berdasar pada teknik klasik ELISA.

Sumur-sumur pada mikrotitter sebagai fase solid dilapisi dengan antigen Toksoplasma
(TOXO-Ag) yang telah disiapkan dari sonicated whole parasit Toxoplasma gondii
(Tachyzoites).

Pada tahap inkubasi pertama memiliki kemiripan spesifik dengan anibodi (TOXO-IgG-Ab)
hadir di spesimen pasien atau kontrol yang mengikat antigen dalam fase solid. Pada
tahap akhir inkubasi komponen yang tidak terikat akan terbuang karena proses
pencucian. Untuk tahap inkubasi kedua konjugat anti-IgG (anti-human antibodi IgG,
konjugat peroksidase) ditambahkan yang mana mengikat secara khusus antibodi kelas
IgG yang mengakibatkan pembentukan khas immunocomplexes/ kompleks imun.

Setelah tahap pencucian kedua untuk menghilangkan konjugat berlebih, TMB/substrat

ditambahkan (tahap 3). Warna biru berubah warna menjadi kuning setelah reaksi
berhenti. Intensitas warna secara langsung berbanding dengan konsentrasi TOXO-IgG-
Ab dalam spesimen.
Reagen dan Kandungannya
Reagen dan Kandungannya
Catatan Keamanan
Stabilitas
Jangan menelan reagen. Hindari
Reagen stabil pada suhu 2-8oC hingga
kontak dengan mata, kulit dan
tanggal kadaluarsa yang tertera pada
membran mukosa. Semua spesimen
label
pasien dan kontrol harus diperlakukan
Setelah reagen dibuka harus disimpan
sebagai bahan infeksius.
pada suhu 2-8oC dan digunakan tidak
lebih dari 60 hari (lihat juga pada
Kontrol telah diperiksa pada tingkat
‘Note!’)
donor untuk HCV dan antibodi HIV ½
dan HbsAg negatif. Menggunakan
pakaian pelindung dan sarung tangan MIC (Kode; TOX G)
disposable menurut Good Laboratory
Terbungkus dalam kantung
Practices.
alumunium dengan pengering
Semua bahan yang terkontaminasi
desiccant
dengan spesimen pasien atau kontrol
Harus dalam keadaan temperatur
harus di inaktivasi dengan prosedur
ruangan sebelum dibuka
yang valid (autoklaf atau tindakan
Jika tidak digunakan; kembalikan
kimia) berdasarkan peraturan yang
dengan desiccant kedalam kantung
berlaku
zip-lock dan simpan pada suhu 2-
8oC
Jangan menyentuh bagian atas dan
dasar sumur dengan jari

Persiapan Reagen
Siapkan semua reagen dalam
temperatur ruang (15-25oC)
sebelum dipakai
Reagen yang tidak dipakai harus
ditempatkan pada suhu 2-8oC
.
Catatan
Tujuan umum reagen; DIL-G, WS,
SUB, STOP dapat ditukar diantara
perbedaan lots dan kit. Untuk test
IgG hanya gunakan buffer
pengencer IgG (revisi lagi)
Semua reagen lain spesifik
untuk………..
Membuat Wash Solution
Encerkan WS 20X (1+19) dengan
air destilasi/aquadest. Contoh; 50
ml WS + 950 ml aquadest = 1000
ml WS
Stabilitas : hingga 60 hari dalam
temperatur 15-25oC
Spesimen
Serum
Jangan menggunakan serum lipemik atau
serum hemolisis
Spesimen disimpan selama 7 hari dalam
temperatur 2-8oC atau jika lebih lama
dalam temperatur -20oC. Bekukan dan
cairkan hanya satu kali saja. Spesimen
yang dicairkan harus dihomogenisasi.
Buang partikel yang tidak diperlukan
dengan sentrifugasi atau filtrasi.
Prosedur
Ikuti prosedur sebagaimana yang dijelaskan.

Catatan Prosedur
P1; jangan mencampur tutup botol kecil (tinggi kontaminasi). Jangan menggunakan reagen setelah
tanggal kadaluarsa
P2; jangan menggunakan reagen yang mungkin terkontaminasi atau terlihat dan berbau berbeda
dari biasanya
P3; catat spesimen dan kontrol dengan hati-hati di kertas dengan kertas kit
P4; MIC pilih nomor yang diperlukan dari microtiter strips
P5; dibuat duplo untuk kontrol. Pipet kontrol dan spesimen pada dasar microwell
P6; selalu tambahkan reagen dalam rangka dan waktu yang sama untuk meminimalisir perbedaan
waktu reaksi diantara sumur
P7; hindarkan atau buang terlebih dahulu gelembung udara pada proses inkubasi dan pembacaan
absorban
P8; SUB-inkubasi dalam gelap. SUB memulai reaksi kinetik yang mana diakhiri dengan STOP.
Prosedur Pencucian
Prosedur pencucian sangat penting. Prosedur pencucian yang tidak mencukupi akan menyebabkan hasil
yang memiliki presisi buruk atau hasil absorban tinggi palsu.

W2:
W1: Bila menggunakan mesin W3:
Lepaskan strip perekat, pencuci otomatis gunakan Setelah pencucian,
buang isi ke dalam larutan larutan pencuci (WASH). hilangkan cairan yang
natrium hipoklorit 5% dan Kemudian cuci strip 4 tersisa dengan mengetuk
tambahkan larutan WASH sampai 5 kali. Pastikan mikroplate di atas kertas
pada setiap well, buang larutan pencuci mengisi tissue.
setelah direndam selama semua well dengan baik
30 detik. Ulangi pencucian dan buang setelah 30
3 sampai 4 kali detik. (cairan yang tersisa
: < 15 µl).
Perhitungan Nilai Kontrol dan
Cut Off
Nilai rata-rata dari Negative Control (MNC), Cut-off Control (MCC), dan Positive Control
Low, Positive Control Medium, Positive Control High (MPCL, MPCM, MPCH) dihitung
berdasarkan contoh berikut:

𝑨𝟒𝟓𝟎 𝑫𝟏 + 𝑨𝟒𝟓𝟎 𝑬𝟏
𝐌𝐂𝐂 =
𝟐

Hasil tes dinyatakan valid dengan syarat sebagai berikut :

• Blanko well A1 < 0,150
• MNC ≤ MCC
• MPCM ≥ 0,750
• MPCM : MNC ≥ 5
 A450 (Pasien) ≥ MNC + 15% anti-TOXO-IgG-Ab-Positive

A450 (Pasien) < MNC – 15% Anti-TOXO-IgG-Ab-Negative

Karena variasi Fisiologis dan Analitis hasil pasien berkisar 15%

di atas atau di bawah perhitungan cut-off kurang tegas. Sangat
direkomendasikan untuk mengukur sampel ini bersamaan
dengan sampel segar yang diambil 7 hingga 14 hari kemudian,

Interpretasi masing-masing duplo. Kecenderungan antara kadar antibodi

yang spesifik harus digunakan sebagai interpretasi, rekam

Hasil medis pasien juga digunakan sebagai pertimbangan.

Kereaktifan yang berulang dan ampel yang kurang tegas perlu
perlakuan untuk tes konfirmasi.
 Tes ELISA untuk Mendeteksi Antibodi
IgM Terhadap Toxoplasma gondii pada
Serum dan Plasma Manusia
Insert the title of your subtitle Here
 Toxo IgM
Tes ELISA untuk Mendeteksi Antibodi IgM
terhadap Toxoplasma gondii pada Serum dan Plasma Manusia

TUJUAN PENGGUNAAN
TOXO IgM ELISA digunakan untuk mendeteksi kelas antibodi Immunoglobulin
M (IgM) terhadap Toxoplasma gondii dalam serum manusia
Toxoplasma hampir menginfeksi semua mamalia dan burung. Penyebaran
Toxoplasma yang paling banyak berasal dari parasit intraselular. Manusia dapat terinfeksi
melalui feses atau daging mentah, atau melalui inokulasi langsung melalui transfusi darah
atau transmisi kongenital.
Ibu hamil yang memperoleh toxoplasmosis pada trimester pertama memiliki
25% resiko dari transmisi fetal yang mengakibatkan aborsi spontan, stillborn (meniggal saat
lahir) atau penyakit yang parah. Enam puluh lima persen bayi yang lahir pada wanita yang
telah terinfeksi saat trimester ketiga memiliki infeksi subklinik yang akhirnya 85%
menimbulkan chrioretinitis atau neurogical squale.
Prinsip
 HUMAN TOXO IgM ELISA menggunakan teknik direct ELISA

 Pada tahap inkubasi pertama, antibodi spesifik yang sesuai (Antibodi TOXO
IgM) terdapat pada spesimen pasien atau kontrol yang akan berikatan dengan
antigen pada fase padat.

 Pada akhir inkubasi, komponen yang tidak terikat dibuang dengan pencucian.

 Pada tahap inkubasi kedua, ditambahkan konjugat anti-IgM (anti-human IgM

antibodi, konjugat peroksida) yang berikatan secara spesifik dengan antibodi
kelas igM yang menghasilkan pembentukan kompleks imun yang khas.

 Setelah langkah pencucian kedua untuk menghilangkan konjugat berlebihan,

ditambahkan substrat TMB (tahap ke-3). Warna biru berubah menjadi kuning
setelah reaksinya dihentikan

 Intensitas warna berbanding lurus dengan konsentrasi TOXO-IgM-Ab pada

specimen

 Absorban dari kontrol dan spesimen dibaca menggunakan ELISA Reades.

 Hasil yang diperoleh dibandingkan dengan nilai cut off.

 Insert Kit
Mikropipet dan
Microtiter strips, Negative Control, Yellow tip
Cut Off Control, Positive Control
(Low, Medium, High), Sample
Dilluent, Enzyme Conjugate, Wash
Solution, Substrate, Stop Solution,
Adhesive Strips.

Persiapan
Alat
Mikropipet
HumaReader Elisa
Multichanel
Reagen dan Isi

Strip Mikrotiter (dalam 1 strip holder)

MIC 12 Strip 8 well yang bisa dilepas
Yang sudah spesifik terhadap anti human IgM

Kontrol Negatif (tutup hijau)

NC 2.3 ml
Siap digunakan, manusia
Kontrol Cut-Off (tutup putih)
CC 2.3 ml
Siap digunakan, manusia
Kontrol Positif (tutup merah)
PC 2.3 ml
Siap digunakan, manusia
Sampel diluen (tutup biru)
pH 7.2 ± 0.2
DIL 100 ml Siap digunakan, berwarna hijau
Phosphate buffer

Enzim Konjugat (tutup kuning)

CON 0,32 ml konsentrasi, berwarna kuning
Konjugat Toxoplasma antigen peroksidase
Reagen dan Isi

Konjugat Diluen (tutup putih) pH 7.2 ± 0.2

C-DIL
15 ml Siap digunakan, berwarna kuning
5121
Buffer fosfat

Larutan Pencuci (tutup putih)

WS 25× Konsentrasi untuk sekitar 2000 ml
80 ml
5102 Buffer fosfat pH 7.1 ± 0.1

Reagen Substrat (tutup hitam)

Siap digunakan, berwarna kebiruan
SUB
15 ml 3,3’, 5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)
Hidrogen peroksida

STOP Larutan Stop (tutup merah)

15 ml
Asam sulfat, siap digunakan 0.5 mol/l
2 Adhesive strips
 Catatan Keamanan
 NC,PC dan CC mengandung sodium azide yang dapat Stabilitas
bereaksi dengan bahan logam di laboratorium yang
menyebabkan ledakan. Reagen stabil pada suhu 2-8oC
hingga tanggal kadaluarsa yang
 STOP Solution tertera pada label .
H315 menyebabkan iritasi kulit Setelah reagen dibuka, harus
H319 menyebabkan iritasi mata yang serius
disimpan pada suhu 2-8oC dan
 Tindakan pencegahan lain
digunakan tidak lebih dari 60 hari
P280 menggunakan sarung tangan atau pelindung mata (lihat juga pada ‘Note!’)
/pelindung pakaian/pelindung wajah.
P305+P351+P338 Jika pada mata : bilas menggunakan air MIC
beberapa menit. Copot kontak lensa,jika menggunakan dan
memungkinkan untuk dilakukan.  Disegel dalam kantung aluminium.

P321 pengobatan spesifik (lihat tabel)
P332+P313 Jika masih ada iritasi kulit : dapatkan
penanganan medis
P337+P313 Jika masih ada iritasi mata : dapatkan
penanganan medis
 Harus berada pada suhu kamar sebelum
dibuka.
 Bila tidak digunakan : disimpan kembali
dalam kantung zip-lock dan simpan pada
suhu 2-8°C
 Jangan menyentuh tepi atas atau dasar
sumur dengan jari
PERSIAPAN REAGEN WORKING LARUTAN PENCUCI
•
01
Bawa semua reagen pada suhu ruang
(15-25°C) sebelum digunakan. 02 1 Bagian diluen WS 25X

dengan 24 bagian air terdeionisasi

Reagen yang tidak digunakan harus yang baru.

selalu disimpan pada suhu 2-8°C . • Mis : 4 ml WS 25X + 96 ml = 100 ml

• Stabil sampai 30 hari

pada suhu 2-8°C

WORKINGKONJUGASOLUTION (WCON)
DIL CON 1 + 50 dengan C-DIL,seperti :
Disiapkan baru
03 setiap hari,
15 menit
sebelum
digunakan
 PERSIAPAN
SPESIMEN
• Encerkan sampel 1+100 dengan
DILUENT.
• Misalnya : 10 μL serum + 1 mL
DILUENT.
• Campur hingga merata.
• Sampel yang sudah diencerkan
dapat disimpan sampai dengan 48
jam pada suhu 2 – 8°C sebelum
dites.
Spesimen : Serum
• Jangan menggunakan serum lipemik
atau serum hemolisis
• Spesimen disimpan selama 7 hari
dalam temperatur 2-8oC atau jika
lebih lama dalam temperatur -20oC.
Bekukan dan cairkan hanya satu
kali saja.
• Spesimen yang dicairkan harus
dihomogenisasi. Buang partikel yang
tidak diperlukan dengan sentrifugasi
atau filtrasi.
 PROSEDUR

• P1 : Jangan mencampurkan tutup botol (resiko kontaminasi). Jangan gunakan

reagen setelah lewat tanggal kadaluarsa.
• P2 : Jangan gunakan reagen yang terkontaminasi atau berbau berbeda dari
biasanya.
• P3 : Catat spesimen dan kontrol dengan hati-hati pada lembar kerja yang
disertakan dengan kit.
• P4 : Pilih jumlah strip mikrotiter yang diperlukan.
• P5 : Lakukan duplo untuk NC,PC,CC. Pipet kontrol dan spesimen di bagian
bawah microwell.
 PROSEDUR

• P6 : Selalu tambahkan reagen dalam urutan dan waktu yang sama untuk
meminimalkan perbedaan waktu reaksi antar well. Ini penting untuk hasil
yang diduplo. Pemipetan spesimen tidak boleh lebih dari 5 menit. Kalau tidak,
pipet kontrol di posisi yang ditunjukkan di separuh waktu dari seri. Jika lebih dari
1 plate digunakan, ulangi kontrol untuk setiap plate.
• P7 : Hindari / hilangkan gelembung udara sebelum inkubasi atau pembacaan
absorban.
• P8 : SUB – inkubasi dalam keadaan gelap. SUB memulai reaksi kinetik, yang
mana akan diakhiri oleh STOP
• P9 : MIC – Ayunkan dengan lembut setelah pemipetan tanpa menumpahkannya
untuk memastikan semua tercampur. Jika ada bisa menggunakan plate shaker
(seperti : HUMAN humareader line)
 PROSEDUR PENCUCIAN
Prosedur pencucian sangat penting. Prosedur pencucian yang tidak mencukupi akan menyebabkan
hasil yang memiliki presisi buruk atau hasil absorban tinggi palsu.

Lepaskan strip Bila menggunakan

mesin pencuci
perekat, buang isi ke otomatis gunakan Setelah pencucian,
dalam larutan natrium larutan pencuci hilangkan cairan
hipoklorit 5% dan (WASH). Kemudian
cuci strip 4 sampai yang tersisa
tambahkan larutan 5 kali. Pastikan dengan mengetuk
WASH pada setiap larutan pencuci mikroplate di atas
well, buang setelah mengisi semua well
dengan baik dan kertas tissue.
direndam selama 30 buang setelah 30
detik. Ulangi detik. (cairan yang
pencucian 3 kali tersisa : < 15 µl).

W1 W2 W3
Persiapan sampel:
Encerkan serum pasien 1:100 dengan DIL, misalnya 10 µl serum + 1 ml DIL, campur hingga merata
Sampel yang telah diencerkan harus digunakan pada hari yang sama.
Control negative, cut of control dan control positif siap digunakan campuran selama 5 detik
Sumur µl
STEP 1 A1 B1-C1 D1-G1 H1
(blanko) (control negative) (Cut off control), (control positif) (sample)

NC - 100 - -
CC, PC - - 100 -
Ssampel yang telah diencerkan 100
Campur secara hati-hati
MIC ditutup menggunakan strip perekat
Inkubasi 60 menit pada suhu 37°C
Lakukan pencucian 4 kali seperti yang sudah dijelaskan (lihat W1-W3)
WASH 300 300 300 300
STEP 2
WCON - 100 100 100
Campur secara hati-hati
MIC ditutup menggunakan strip perekat
Inkubasi selama 30 menit pada suhu 37°C
Lakukan pencucian 4 kali seperti yang sudah dijelaskan (lihat W1-W3)
WASH 300 300 300 300
STEP 3
SUB 100 100 100 100
Inkubasi selama 30 menit pada suhu 17-25°C
STOP 100 100 100 100
Campur secara hati-hati
Mengukur absorbansi pada 450 nm sesegera mungkin atau dalam 10 menit. Setelah mengakhiri reaksi, menggunakan panjang gelombang referensi 630-690 nm
 SKEMA PEMIPETAN
STEP 1

1. Dipipet NC sebanyak 100 ul pada sumur B1-C1

2. Dipipet CC dan PC sebanyak 100 ul pada sumur D1-
G1
3. Dipipet sampel yang telah diencerkan dengan diluent
sebanyak 100 ul
4. Campur secara hati-hati
5. Ditutup dengan adhesive strip
6. Inkubasi selama 60 menit pada suhu 37ºC
7. Lakukan pencucian sebanyak 4x dengan
menambahkan 300 ul wash solution selama 30 detik
 SKEMA PEMIPETAN
STEP 2

1. Dimasukkan konjugat sebanyak 100 ul ke

semua sumur kecuali A1
2. Campur secara hati-hati
3. Ditutup dengan adhesive strips
4. Inkubasi selama 30 menit pada suhu 37ºC
5. Lakukan pencucian sebanyak 4x dengan
menambahkan 300 ul wash solution selama 30
detik
 SKEMA PEMIPETAN
STEP 3

1. Dimasukkan subsrat 100 ul ke semua sumur

2. Inkubasi selama 30 menit pada suhu 17-25ºC
3. Dimasukkan larutan STOP 100 ul ke semua
sumur
4. Ukur A1 sebagai blanko. Absorban harus
sesegera mungkin diukur maksimal 10 menit
pada panjang gelombang 450 nm dan panjang
gelombang refrensi 630-690 nm
 Perhitungan Nilai Kontrol Dan Cut Off
Perhitungan dari Nilai rata-rata dari Negative
Control (MNC),Positif kontrol (MPC) dan MCC
dihitung berdasarkan contoh berikut:
Hasil tes dinyatakan valid dengan syarat
𝑨𝟒𝟓𝟎 𝑩𝟏 + 𝑨𝟒𝟓𝟎 𝑪𝟏 sebagai berikut :
𝐌𝑵𝐂 =
𝟐 • MNC <0,150
𝑨𝟒𝟓𝟎 𝑫𝟏 + 𝑨𝟒𝟓𝟎 𝑬𝟏 • Your
MCC> 0,200
Text Here
𝐌𝐂𝐂 =
𝟐
• MPC/COV≥ 2,0
𝑨𝟒𝟓𝟎 𝑭𝟏 + 𝑨𝟒𝟓𝟎 𝑮𝟏 Your Text Here
𝐌𝑷𝐂 = • 𝑨𝟒𝟓𝟎 Blanko ≤ 0,100
𝟐

Cut Off Value (COV) = MCC

 Interpretasi Hasil
Hasil Interpretasi

A450 (Spesimen) < COV - 10% Non Reaktif

A450 (Spesimen) > COV + 10%

Reaktif

A450 (Spesimen) ≥ COV - 10% Your :Text Here

SAMAR tes ulang
dan
A450 (Spesimen) ≤ COV + 10%
Your Text Here

Tingkat kontrol yang tidak diketahui/tak

Invalid (salah prosedur) : tes ulang
terduga

Hasil yang positif harus dikaitkan dengan evaluasi klinis dan diagnosis prosedur.
Perhitungan yang diperoleh dimaksudkan untuk pertolongan dalam mendiagnosis
Karakteristik Kinerja
Catatan
Komponen kit stabil sampai tanggal kedaluwarsa
bahkan setelah dibuka.
Namun, kontaminasi potensial secara langsung terkait
dengan jumlah sampling.

Batas 60 hari setelah penggunaan pertama

ditetapkan untuk alasan keamanan.
Penanganan harus selalu sesuai dengan persyaratan
GLP umum. Kriteria validasi harus dipenuhi
Tes ELISA untuk Mendeteksi Antibodi
IgG Anti-Virus Rubella pada Serum
Menusia
 RUBELLA
• suatu penyakit yang umum dan biasanya terjadi pada anak-anak
dan dewasa. Secara medis yang paling utama berasal dari efek
teratogenik ketika wanita melahirkan anak. Menyebabkan cacat
bawaan termasuk tuli, katarak, diabetes dan kelainan jantung dan
tulang.

• Kehadiran IgM spesifik Rubella pada neonatus atau persistensi

titer antibodi IgG yang tinggi lebih dari 6 bulan menegaskan
diagnosis rubella kongenital.
• Wanita hamil dengan infeksi rubella saat ini harus melakukan
konseling konsekuensi dari infeksi kongenital
rubella kongenital ditularkan dari ibu yang mengalami viremia.
adanya antibodi maternal yang bersirkulasi menunjukkan
kekebalan terhadap rubella dan secara virtual menyingkirkan
kemungkinan penularan rubella ke janin
Infeksi rubella akut dapat dikonfirmasi dengan secara bersamaan
menguji pasangan sera akut dan sembuh dan mencari
seroconversion, atau dengan mendeteksi Rubella spesifik IgM.
 PRINSIP
HUMAN RUBELLA IgG ELISA didasarkan pada teknik ELISA klasik. Microwell ELISA
dilapisi dengan antigen virus rubella murni (VR-Ag). Pada langkah inkubasi pertama, antibodi anti-
Rubella virus IgG (anti-VR-IgG Ab) yang terkandung dalam tes atau kontrol secara khusus terikat
pada antigen yang tidak bergerak. Pada akhir inkubasi, komponen yang berlebihan dihilangkan
dengan pencucian. Pada langkah inkubasi kedua, konjugat anti-IgG (antibodi anti-IgG-manusia,
dilabeli dengan peroksidase) ditambahkan yang akan berikatan secara spesifik dengan antibodi
IgG. Kompleks imun yang khas terbentuk. Setelah melepaskan konjugat yang berlebihan dengan
pencucian (pencucian kedua) dan penambahan TMB / Substrat (langkah 3), warna biru terbentuk
lalu berubah menjadi kuning setelah penghentian reaksi. Intensitas warna ini berbanding lurus
dengan jumlah antibodi IgG anti-VR dalam sampel.

Absorbansi kontrol dan sampel ditentukan menggunakan pembaca microwell ELISA atau
sistem yang otomatis (misalnya instrumen HUMAREADER atau ELISYS line). Hasil pasien
diperoleh dengan perbandingan dengan nilai cut-off atau dengan estimasi kuantitatif dalam IU/ml
berdasarkan kurva kalibrasi yang dibangun dengan nilai kontrol cut-off dan kontrol positif.
 BAHAN YANG TERSEDIA DALAM KIT
Mikroplate Kontrol Cut-Off Kontrol positif Kontrol negatif
96 sumur dalam 15 IU/mL (kuning), 25 &
50 IU/mL, 1 mL dari <15 IU/mL, 1 mL
12x8 strip terpisah, 100 IU/mL (biru), 1 mL
10 mm Tris-buffered dari 10 mm Tris-
dilapisi dengan dari 10 mm Tris-buffered
saline mengandung buffered saline
antigen virus rubella saline dengan antibodi
antibodi rubella pada mengandung serum
yang tidak aktif IgG terhadap rubella pada
serum manusia. manusia normal,
. serum manusia. Siap
. hijau. Siap
untuk digunakan.
. digunakan
.

Diluent Buffer Wash Buffer Konjugat Substrat TMB Larutan stop

IgG 100 mm Tris- IgG rabbit anti human larutan encer dari 0,25 M asam sulfat,
buffered saline yang terkonjugasi TMB dan hidrogen 12 mL. Siap untuk
150 mm Tris-
dengan detergen, pH Dengan Horseradish peroksidase, 12 mL. digunakan
buffered saline
7,2 100 mL, peroksidase dalam Siap untuk
(TBS), pH 7,2
konsentrat (x10) larutan penstabil digunakan
dengan agen
. protein dan agen
antimikroba, 10 mL,
antimikroba, 12 mL.
(biru), konsentrat
Siap untuk digunakan
(x15)
.
BAHAN YANG TERSEDIA DALAM KIT
Pembaca mikroplate EIA dengan
panjang gelombang 450 nm dan pilihan
620 nm dengan filter. Alternatifnya, Tabung tes untuk
sistem otomatisasi yang divalidasi pengenceran
sendiri yang sesuai dapat digunakan. 01 02
.

Air suling/aquades Tabung baru untuk

. mempersiapkan
06 03
wash buffer

Pencuci mikroplate Mikropipet dan tip

EIA atau pipet 05 04 sekali pakai untuk
multichannel atau memindahkan 10 uL,
botol cuci. Kertas Penyerap. 100 uL, 1 mL
 Catatan keamanan
• Jangan menelan reagen.
• Hindari kontak dengan mata, kulit dan selaput lendir. Semua spesimen
dan kontrol pasien harus ditangani sebagai berpotensi menular.
• Kontrol telah diperiksa pada tingkat donor untuk antibodi HCV dan HIV-
1/2 dan HBsAg dan ditemukan negatif.
• Pakailah pakaian pelindung dan sarung tangan sekali pakai sesuai
dengan Good Laboratory Practices (GLP).
• Semua bahan yang terkontaminasi dengan spesimen atau kontrol
pasien harus dinonaktifkan dengan prosedur yang divalidasi (Autoclave
atau treatment bahan kimia) sesuai dengan peraturan yang berlaku.
• Larutan STOP dapat mengiritasi mata, kulit, dan selaput lendir. Jika
terkena, cuci bersih dengan banyak air dan konsultasikan dengan dokter.
 Pembuatan wash solution Persiapan reagen

• Bawa semua reagen

• Encerkan wash solution
pada suhu ruang
21× 5102 1:20 dengan
air deionisasi. Misalnya (15…25°C) sebelum
50 mL WS 20× 5102 + digunakan.
1000 mL = 1050 mL.
• Reagen yang tidak
• Stabilitas : sampai
dengan 60 hari pada digunakan harus selalu
suhu 15...25°C. disimpan pada suhu
2…8°C.
 Catatan khusus Stabilitas MIC : ( kode RUB G )

Reagen yang umum digunakan Pereaksi stabil hingga • Disegel dalam kantung
diluent, wash solution, substrat, tanggal kedaluwarsa yang aluminium dengan desiccant.
dan stop solution ada yang dinyatakan pada masing- • Harus pada suhu kamar
dapat ditukar antar lot dan kit masing label bila disimpan sebelum dibuka.
yang berbeda. Untuk uji IgG pada 2 ... 8 ° C. • Tidak digunakan: simpan
hanya digunakan buffer diluent Setelah pembukaan reagen kembali dengan dessicant ke
IgG. harus disimpan pada suhu 2 dalam kantung zip-lock dan
... 8 ° C dan digunakan simpan pada suhu 2...8°C
Semua reagen spesifik untuk lot
dalam waktu 60 hari (lihat Jangan menyentuh tepi atas atau
individual dan tidak boleh
juga "Catatan"). dasar sumur dengan jari
ditukar dengan lot yang lain.
Tidak ada reagen lain yang
harus digunakan bersama
dengan kit ini.
 Pengambilan spesimen dan penyimpanan

 Sampel serum dan plasma yang sudah digunakan harus disimpan

pada suhu -20○C untuk penyimpanan jangka panjang

 Sampel yang dibekukan harus tercampur dengan baik setelah

pencairan dan sebelum digunakan. Pengulangan pembekuan dan
pencairan dapat mempengaruhi hasil

 Penambahan pengawet kedalam serum sampel dapat menyebabkan

efek merugikan pada hasil.

 Kontaminasi mikrobiologi, pemanasan atau specimen berisi partikel

tidak boleh digunakan.

 Hindari Hemolisis, ikterik, atau specimen lipemik

 PERSIAPAN SAMPEL

• Encerkan sampel 1+100 dengan DIL-G.

Misalnya : 10 μL serum + 1 mL DIL-G.
Campur hingga merata.
• Sampel yang sudah diencerkan dapat
disimpan sampai dengan 48 jam pada
suhu 2 – 8°C sebelum dites.
 CATATAN PROSEDURAL
• P1 : Jangan mencampurkan tutup botol (resiko kontaminasi). Jangan gunakan reagen setelah lewat
tanggal kadaluarsa.

• P2 : Jangan gunakan reagen yang terkontaminasi atau berbau berbeda dari biasanya.

• P3 : Catat spesimen dan kontrol dengan hati-hati pada lembar kerja yang disertakan dengan
kit.

• P4 : Pilih jumlah strip mikrotiter yang diperlukan.

• P5 : Lakukan duplo untuk kontrol. Pipet kontrol dan spesimen di bagian bawah microwell.

• P6 : Selalu tambahkan reagen dalam urutan dan waktu yang sama untuk
meminimalkan perbedaan waktu reaksi antar well. Ini penting untuk hasil yang diduplo.
Pemipetan spesimen tidak boleh lebih dari 5 menit. Kalau tidak, pipet kontrol di posisi yang
ditunjukkan di separuh waktu dari seri. Jika lebih dari 1 plate digunakan, ulangi kontrol untuk
setiap plate.

• P7 : Hindari / hilangkan gelembung udara sebelum inkubasi atau pembacaan absorban.

• P8 : SUB – inkubasi dalam keadaan gelap. SUB memulai reaksi kinetik, yang mana akan
diakhiri oleh STOP
 PROSEDUR PENCUCIAN
W1: W2: W3:
Lepaskan strip Bila menggunakan Setelah
perekat, buang isi ke mesin pencuci pencucian,
dalam larutan otomatis gunakan hilangkan
natrium hipoklorit 5% larutan pencuci cairan yang
dan tambahkan (WASH). Kemudian tersisa dengan
larutan WASH pada cuci strip 4 sampai 5 mengetuk
setiap well, buang kali. Pastikan larutan mikroplate di
setelah direndam pencuci mengisi semua atas kertas
selama 30 detik. well dengan baik dan tissue.
Ulangi pencucian 3 buang setelah 30 detik.
sampai 4 kali. (cairan yang tersisa : <
15 µl).
Reagen dan specimen harus pada suhu ruang sebelum digunakan.
Persiapan Sampel : Encerkan serum pasien 1:100 dengan DIL-G, misalnya 10 μL serum + 1 mL, campur hingga merata.
Kontrol siap digunakan.
Well [μl]
Step 1 A1 B1/C1 D1/G1 H1…
Blanko NC CC, PC Spesimen
NC, duplo -- 100 -- --
CC, duplo, D1/E1 -- -- 100 --
PC, duplo, F1/G1 -- -- 100 --
Sampel yang diencerkan -- -- -- 100
MIC ditutup dengan menggunakan Adhesive Strips
Inkubasi selama 30 menit pada suhu 17…25°C
Lakukan pencucian 4 kali seperti yang sudah dijelaskan (lihat W1-W3)
WASH 350 350 350 350
Step 2
CON -- 100 100 100
MIC ditutup dengan menggunakan Adhesive Strips
Inkubasi selama 30 menit pada suhu 17…25°C
Lakukan pencucian 5 kali seperti yang sudah dijelaskan (lihat W1-W3)
Step 3
SUB 5103 100 100 100 100
Inkubasi selama 30 menit pada suhu 17…25°C
STOP 5104 100 100 100 100
Baca absorban pada panjang gelombang 450 nm sesegera mungkin atau kurang dari 30 menit. Setelah penghentian reaksi, gunakan panjang
gelombang referensi 630-690 nm (jika tersedia).
 PERHITUNGAN NILAI CONTROL DAN CUT-OFF
Nilai rata-rata dari Negative Control (MNC), Cut-off Control (MCC),
dan Positive Control (MPC) dihitung sebagai berikut :

𝑨𝟒𝟓𝟎 𝐁𝟏 + 𝑨𝟒𝟓𝟎 𝐂𝟏
𝐌𝐍𝐂 =
𝟐

𝑨𝟒𝟓𝟎 𝑫𝟏 + 𝑨𝟒𝟓𝟎 𝑬𝟏
𝐌𝐂𝐂 =
𝟐

Hasil tes dinyatakan valid dengan syarat

𝑨𝟒𝟓𝟎 𝐅𝟏 + 𝑨𝟒𝟓𝟎 𝐆𝟏
𝐌𝐏𝐂 = sebagai berikut :
𝟐
• Blanko well A1 < 0,150
. • MNC ≤ MCC
• MPC ≥ 0,750
• MPC : MNC ≥ 2,5
 A450 (Pasien) ≥ MNC + 15% anti-VR-IgG-Ab-Positive

A450 (Pasien) < MNC – 15% anti-VR-IgG-Ab-Negative

Karena variasi Fisiologis dan Analitis hasil pasien berkisar 15%

di atas atau di bawah perhitungan cut-off kurang tegas. Sangat
direkomendasikan untuk mengukur sampel ini bersamaan
dengan sampel segar yang diambil 7 hingga 14 hari kemudian,

Interpretasi masing-masing duplo. Kecenderungan antara kadar antibodi

yang spesifik harus digunakan sebagai interpretasi, rekam

Hasil medis pasien juga digunakan sebagai pertimbangan.

Kereaktifan yang berulang dan ampel yang kurang tegas perlu
perlakuan untuk tes konfirmasi.
Thank you