Anda di halaman 1dari 21

SITOKIMIA

A4
PENGERTIAN

• Sitokimia merupakan metode pewarnaan tertentu


sehingga hsailnya spesifik daripada hanya
menggunakan morfologi sel blas pada apusan
darah tepi atau sumsum tulang.

• Pewarnaan sitokimia suatu pengujian tentang


elemen kimiawi yang terdapat pada sel ,yaitu
elemen enzimatik (peroksida)dan non enzimatik
(lipid,glikogen).
• Pewarnaan ini membantu mengkonfirmasi
kandungan granula dari sel ganas,yang
bermanfaat dalam menggolongkan sel limfosit
dan meilosit pada leukimia.

• Pengecatan sitokimia pada leukimia dapat


membantu membedakan 1 sel dengan yang lain
terutama membedakan antara leukimia limfoid
dan mieloid.
MACAM-MACAM PENGECATAN

1. Pengecatan peroksidase
Adakalanya pembedaan jenis
leukosit menemui kesukaran,
teristimewa jika menghadapi sel
muda atau abnormal. Dalam
keadaan itu boleh dipergunakan
kenyataaan bahwa granula dalam
sel jajaran limfosit tidak ada. Salah
satu yang sering dipakai untuk
membedakan sel jajaran granulosit
dan monosit dari jajaran limfosit
atas dasar ada atau tidaknya
peroxidase ialah pulasan menurut
sato dan sekiya.
REAGEN

1. Larutan Cupri Sulfat : CuSO4.5 H2O 0,5 gram dalam


100 ml aquadest.
2. Larutan benzidine : benzidine basa 0,2 gram digerus
dalam cawan porselin dalam 200 ml aqudest. Disaring
dan tambahkan 0,25 ml H2O 23% dan simpan dalam
botol coklat. Tahan selama 6 bulan.
3. Larutan Safranin : safranin 1 gram dalam 100 ml
aquadest.
.
Cara Kerja

1. Letakkan sediaan kering dan difiksasi di atas rak.


2. Genangi sediaan dengan larutan kuprisulfat selama 30 –
60 detik.
3. Buang larutan tadi dan genangi dengan larutan
benzidine selama 2 menit.
4. Bilas dan warnai dengan larutan safranin selama 1
menit.
5. Bilas dan keringkan.

Hasil : Plasma jajaran granulosit berwarna biru sedangkan


granula berisi peroksidase akan berwarna hijau biru.
Mielobast dengan hasil negatif. Monosit memiliki granula
namun terlihat kecil-kecil. Limfosit tidak ada dan berwarna
merah
MACAM-MACAM PENGECATAN

2. Pengecatan SBB (sudan black B)

Dasar pewarnaan sudan black B adalah pewarnaan


lemak. Pewarnaan ini dipakai untuk mewarnai granula
netrofil karena membran granula neutrofil
mengandung fosfolipid.
Ada korelasi antara sudanfilia dengan aktivitas
mieloperoksidase, mungkin hal ini disebabkan oleh
pewarnaan lemak pada granula oleh sudan black B
sedangkan mieloperoksidase terdapat didalam granula atau
zat warna itu bereaksi melalui ativitas enzim.
PRINSIP & REAGEN

• PRINSIP
• Zat warna Sudan Black memberi warna hitam kepada granula
dalam leukosit yang mengandung zat lemak. Antara
sudanofilia dan reaksi peroksidase positif terhadap korelasi.

• REAGEN
1. Larutan Sudan Black : 0,5 gram Sudan Black B dicampur
dengan 100 mL etanol absolut. Biarkan selama 2 hari dan
saring.
2. Larutan Buffer : Phenol 16 gram, etanol absolut 30 mL,
Na2HPO4.12H2O 0,3 gram dan aquadest 100 Ml
3. Larutan Kerja : Homogenkan 60 mL larutan Sudan Black dan
40 mL Buffer. Saring.
CARA KERJA

1. Sediaan direkatkan dengan uap formalin dalam


wadah tertutup selama 10 menit.
2. 2. Genangi sediaan dengan larutan kerja selama
30 menit.
3. 3. Bilas dengan etabol absolut dan bilas dengan
air.
4. Bisa juga di warnai dengan safranin 0,1 %.

Hasil : Granula yang mengandung lipid/lemak akan


berwarna hitam.
MACAM-MACAM PENGECATAN

3. Pengecatan PAS(Perdic acid schif)

Pulasan ini sangat berguna untuk menegenali


sel-sel dalam jajaran . limfosit yang
mengandung glikogen. Reaksi yang terjadi
adalah oksidasi glikogen oleh periodat
(periodic acid) menjadi aldehida kemudian
aldehida bereaksi dengan reagean schiff
dengan menyusun warna merah. Singkatan
PAS umum dipakai sebagai singkatan periodic
acid-shiff. Pulasan ini berguna untuk mengenali
sel-sel dalam jajaran limfosit yang
mengandung glikogen. Reaksi yang terjadi
adalah oksidasi glikogen oleh asam periodat
(periodic acid) menjadi aldehide, lalu bereaksi
dengan reagen schiff menjadi warna merah.
REAGEN

Larutan yang diperlukan :


1. Larutan asam periodat : HIO4. 2H2O 1 gram
dalam 100 mL aquadest.
2. Reagent Schiff : Basic Fuchsin 1 gram dimasukkan
dalam 400 mL air mendidih, biarkan dingin sampai
50°C, saring, tambah 1 mL thionylchloride (SOCl2),
simpan tempat gelap 24 jam, tambah 2 gram
carbon adsorbens, kocok saring, simpan lemari es
dalam botol gelap.
3. Larutan hematoksilin 2 gram dalam 100 mL
aquades.
CARA KERJA
1. Sediaan hapus direkatkan denga uap formalin dalam
cawan petri selama 10 menit.
2. Bilas dengan air selama 15 menit.
3. Genangi sediaan dengan asam periodat selama 30
menit.
4. Bilas dengan aquadest, genangi dengan reagent
schiff selama 30 menit.
5. Bilas dengan air, bilas dengan aquadest selama 5
menit.
6. Genangi dengan hematoksilin selama 10 menit.

Hasil : Granula dalam leukosit yang berisi glikogen menjadi


merah.
MACAM-MACAM PENGECATAN

4. Pengecatan LAP (leukocyte alkaline phosphatase)

Adanya enzime dalam granula dan sitoplasma sel-sel


jajaran granulosit dapat dipergunakan untuk membedakan
dari leukosit-leukosit jajaran lain. Hasil pulasan ini juga dapat
memberi petunjuk dalam membedakan leokositosis oleh
leukemia granulositik kronik dari leukositosis.

Darah untuk membuat sediaan apusan sebaiknya


darah kapiler, darah vena dengan antikoagulasi heparin
atau oxalat seimbang dapat dipakai juga asal saj sedian
apus dibuat segera setelah venapungsi. Darah EDTA tidak
boleh dipakai karena EDTA menggangu pulasan terhadap
fosfatasa alkalis
Adanya enzim ini dalam granula dan sitoplasma sel-sel jajaran
granulosit dapat dipergunakan untuk membedakannya dari leukosit-
leukosit lainnya. Hasil pulasan ini memberikan petunjuk dalam
membedakan leukositosis oleh leukemia granulositik kronik dari leukositosis
oleh sebab-sebab lain.
Darah segar sebaiknya digunakan : kapiler, darah vena dengan
antikoagulan heparin atau double oxalat. Darah EDTA tidak boleh
digunakan karena mengganggu pulasan.
REAGEN

Metode Kaplow LAP Larutan yang diperlukan :


1. Larutan perekat : formalin (40%) 10 mL, metanol absolut 90
mL. simpan dalam lemari es freezzer. Sebagian larutan
diambil dan ditaruh pada suhu 5°C.
2. Larutan stok propanadiol : 2-amino-2-metil-1,3-propanadiol
10,5 gram dalam aquadest 500 mL.
3. Larutan kerja Buffer Proponadiol : larutan stock proponadiol
0,2 M 25 mL, larutan HCl 0,1 N 5 mL dan aquadest 100 mL
dan pH harus 9,75 dan simpan dalam lemari es.
4. Larutan substrat pH 9,5 – 9,6 : natrium alfa naftil fosfat 35 mg.
fast blue RR 35 mg, larutan kerja proponadiol 35 mL, saring.
Larutan ini harus segar dan tidak boleh ditunda.
5. Larutan hematoksilin menurut Harris.
CARA KERJA
1. Fiksasi : formalin aseton 30 detik
2. Bilas dengan air kran dan keringkan
3. Tambahkan Fast Garnet GBC pada buffer
4. Tambahkan 0,5 ml a-naphtol butyrate atau larutan aseton
5. Inkubasi selama 20-40 menit
6. Bilas dengan air kran
7. Counterstain : Aqueous Haematoxylin selama 1-5 menit

Hasil : reaksi granuler coklat mayoritas monosit ± 80% tercat


kuat , neutrofil, eosinofil, basofil dan platelet negative. Limfosit B
negative, T tidak tercat.
Pada bonemarrow : monosit dan makrofag tercat kuat.
A-naphtol butyred lebih spesifik untuk identifikasi komponen
monosit dalam AML dripada a-naphtol acetate.
GAMBAR DALAM MIKROSKOP

• Sudan Black • Peroksidase


• PAS • LAP
KESIMPULAN

• Pengecatan Sitokimia pada leukemia adalah untuk


membedakan antara leukemia Limfoid dan Mieloid
• Terdapat banyak jenis pengecatan Sitokimia, namun
yang sering digunakan ada 4 yakni :

1) Pengecatan Peroxydase
Yakni untuk membedakan sel jajaran granulosit dan
monosit dari jajaran limfosit atas dasar ada atau tidaknya
peroxidase

2) Pengecatan Sudan Black


Mewarnai granula sitoplasma yang mengandung
fosfolipid intraseluler dan lipid yang ada dalam leukosit
darah, berwarna coklat kehitaman
3) Pengecatan PAS (Periodic Acid Schiff)
Untuk mendeteksi glikogen oleh periodic acid
menjadi dialdehida, kemudia diahl dehida bereaksi
dengan reagen schiff membentuk warna merah

4) Pengecatan LAP (Leukocyte Alkaline Phosphatase)


Akan membentuk atau memberikan komplek
warna biru karena substrat mengandung napthole
phospat yang terhidrolisis menjadi naphtole azodye
TERIMAKASIH

SEKIAN,
TERIMAKASIH