HPLC

 HPLC atau disebut KCKT dikembangkan pd

akhir thn 1960-an & awal thn 1970-an
 KCKT paling sering digunakan untuk
menetapkan kadar senyawa2 trtntu (asam
amino, asam2 nukleat, protein2 dlm cairan
fisiologis, menentukan kadar senyawa2
aktif obat, memurnikan senyawa dlm dlm
suatu campuran, memisahkan polimer, dll.
Prinsip Dasar HPLC
 HPLC  sebuah instrument yg menggunakan
prinsip kromatografi dgn menggunakan fase
gerak cair  dialirkan melalui kolom (fase
diam)  detektor (bantuan pompa).
 Sampel dimasukkan ke dlm fase gerak dgn
cara penyuntikan
 Pemisahan senyawa berdasarkan kepolaran yg
berbeda
 Senyawa yg keluar dari kolom dideteksi oleh
detektor dan direkam dlm bentuk
kromatogram
 Kegunaan HPLC/KCKT
 Pemisahan sejumlah seny.organik, anorganik,
maupun seny.biologis
 Analisis senyawa tdk mudah menguap (non
volatile)
 Isolasi dan pemurnian senyawa
 Pemisahan seny2 yg strukturnya hampir sama
 Pemisahan seny2 dlm jml sedikit sekali (trace
elements)
 Menetapkan kadar seny2 tertentu
Kelebihan HPLC/KCKT
 KCKT dapat dipakai untuk senyawa non volatile dan
senyawa berbobot molekul tinggi.
 KCKT dapat dipakai untuk senyawa anorganik yg sebagian
besar non volatile.
 KCKT biasanya dilakukan pada suhu kamar sehingga aman
bagi senyawa yg tidak tahan panas
 Mudah melaksanakannya
 Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
 Fase gerak pada KCKT dapat diubah dengan mencampur
pelarut dalam berbagai gradient
 Dapat digunakan bermacam-macam detektor
 Kolom dapat digunakan kembali
Instrumentasi KCKT
Intrumentasi HPLC terdiri dari wadah fase gerak, pompa,
injektor, kolom, detektor, dan pengolah data.
 Wadah fase gerah harus bersih dan lembam
(inert)
 Wadah ini biasax dpt menampung fase gerak
antara 1-2 L pelarut
 Sebelum fase gerak digunakan harus
dilakukan degassing (penghilangan gas) yg
ada pd fase gerak
 Fase gerak harus disaring terlebih dahulu
untuk menghindari adanya partikel2 kecil
 Fase gerak/eluen berupa zat cair. Selain sbg
pembawa seny.campuran menuju detektor,
fase gerak harus dpt berinterakasi dgn
solut2.
 Syarat yg harus dimiliki oleh fase gerak :
 Kemurnian tinggi (high purity)
 Kestabilan tinggi
 Kekentalan rendah
 Dapat melarutkan sampel
 Berdasarkan kepolaran fase gerak
dibandingkan fase diamnya, fase gerak
dibedakan menjadi 2, yaitu:
 Fase normal  Fase diam lebih polar
 Fase terbalik  Fase diam kurang polar
 Pompa yg cocok digunakan pd KCKT harus inert
terhadap fase gerak
 Bahan yg umum dipakai untk pompa; gelas, baja
tahan karat, teflon, batu nilam
 Pompa yg digunakan sebaikx mampu memberikan
tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan
fase gerak dgn kec.alir 3mL/menit
 Tujuan penggunaan pompa atau sist.penghantaran
fase gerak adalah untuk menjamin proses
penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat,
reprodusibel, konstan, bebas dri gangguan
 Seperti kromatografi lain, elusi adalah proses fase
gerak membawa sample menelusuri kolom.
 Elusi dapat dilakukan dg 2 cara yaitu;
 Elusi Isokratik  elusi dilakukan dgn 1 mcam pelarut
atau lbih dgn prbandingan tetap (ex: metanol:air =
50:50% v/v)
 Elusi Bergradien  Elusi dilakukan dgn pelarut
campuran yg prbandinganx berubah-ubah dlm waktu
trtntu. (Ex; Metanol:air = 40:60% v/v)
 Elusi bergradien ini digunakan untuk memperoleh
pemisahan (puncak) yang lebih baik.
 Sistem elusi isokratik memiliki kelemahan:
 Pd awal elusi mnghasilkan resolusi yg kurang baik
 Pd elusi yg lbih lanjut mnghasilkan pnambahan lbar
puncak dgn penurunan tinggi puncak
 Membutuhkan waktu analisis yg lama
 Elusi gradien mmbrikan bbrpa kelebihan:
 Mmungkinkan untuk mnghasilkan kromatogram yg ideal
 Mnghasilkan resolusi yg optimum antr puncak
 Mnghasilkan lbar puncak yg seragam untuk semua puncak
 Mmbutuhkan waktu analisis yg lbih pndek
 Kolom merupakan bagian yg sngat
penting, sbb pemisahan komponen2 trjdi
di dlm kolom.
 Bbrpa hal yg hrus diprhtikan:
 Pemilihan kolom yg sesuai
 Pemeliharaan kolom
 Uji trhdap spesifikasi kolom
 Ada 2 jenis kolom ditinjau dari ukuran (panjang & diameterx) HPLC
yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.
 Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding
dengan kolom konvensional, yakni:
 Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil
dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor
kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).
 Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor
lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
 Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat,
karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas
misal sampel klinis.
 Kolom..
• Dalam prakteknya, kolom mikrobor tidak
setahan kolom kovensional dan kurang
bermanfaat untuk analisis rutin
 Detektor dikelompokkan menjadi 2, yaitu; detektor
universal dan detektor yg spesifik
 Detektor yg ideal mmpunyai karakteristik sbb:
 Respon trhdp solut cepat
 Sensitifitas tinggi
 Stabil dlm pengoperasian
 Sel volume kecil
 Tdk peka terhdp perubahan suhu dan kec.alir fase gerak
 Performance kolom menurun seiring dengan
lamanya waktu penggunaan, yang ditandai dengan
peningkatan “backpressure” dan lebar puncak
kromatogram
 Untuk pengoperasian kolom, Selalu flush (aliri)
kolom dengan pelarut kuat (strong solvent) seperti
metanol sebelum digunakan untuk mengeliminasi
setiap anlit yang tertahan kuat
 Jangan pernah biarkan komponen bufer tertinggal
dalam dalam pompa atau kolom,
 Bersihkan kolom dengan solven yang kuat.
 Untuk kolom Reversed-phase:
gunakan campuran 96% diklorometan dan
4% metanol dengan 0,1% amonium
hidroksida
 Untuk kolom Normal-phase:
gunakan metanol
Detektor Spektrofotometri UV-VIS
• Paling sering digunakan (analisis bidang
farmasi)  kebanyakan seny.obat mmpunyai
struktur yg dpt mnyerap sinar UV-Vis

Detektor Photodiode-array (PDA)

Detektor Fluoresensi

Detektor Indeks bias

Detektor elektrokimia
Kromatografi adsorbsi
• Cocok untuk pemisahan seny2. yg bersifat polar
• Partikel-partikel silika atau alumina biasanya digunakan sebagai
adsorben.
• Jenis kromatografi ini menggunakan fasa gerak non polar seperti
heksana  kromatografi fasa normal.

Kromatografi Partisi
• Kromatografi partisi sangat cocok untuk pemisahan senyawa-
senyawa non polar  disebut juga kromatografi fase terbalik/fase
terikat
• Fase diam yang digunakan silika yg dimodifikasi (oktadesilsilana,
oktasila, atau fenil)
Kromatografi Penukar Ion
• KCKT penukar ion menggunakan fase diam yg dpt
menukar kation/anion dgn fase gerak
Kromatografi ekslusi ukuran
• KCKT ini dpt digunakan untuk memisahkan atau
menganilisis seny.dgn berat molekul >2000 dalton
• Fase diam yg digunakan berupa silika atau polimer
yg bersifat porous  solut dpt melewati porous
Hasil dari pemisahan kromatografi biasanya
ditampilkan dalam bentuk kromatogram pada rekorder.
 HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri
farmasi dan pestisida.
 Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai
polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
 Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang
dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori
 Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin
Zipax-SAX.
 Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air.
 Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-
masalah biokimia.
 Kromatografi cairan kinerja tinggi (KCKT/HPLC) digunakan untuk
memisahkan golongan-golongan takatsiri, misalnya terpenoid tiggi,
segala jenis senyawa fenol, alkaloid, lipid dan gula