1.

Nadya Nitami (16330123)

2. Asniatul Ania (16330131)
3. Nurul Hidayati H. (16330137)
4. Indria Apriska (16330140)\
5. Yusuf Chairi Utama (16330754
• Oksitetrasiklin adalah antibiotik golongan tetrasiklin yang
bersifat bakteriostatik pada konsentrasi rendah dan
bakteriosidal pada konsentrasi tingggi, aktif terhadap Gram
positif maupun Gram negatif. Kerjanya menghambat sintesis
protin bakteri pada ribosomnya.
• Streptomisin, Kanamisin dan Gentamisin merupakan antibiotik
golongan aminoglokosida yang bersifat bakterisidal yang
mampu membunuh bakteri gram negatif dengan cara berdifusi
pada membran sel bakteri dan masuk ke dalam sel bakteri
SAMPLE
• Sampel yang digunakan dalam penelitian ini berupa feses dalam
keadaan segar, yang berasal dari babi muda yang berumur antara 1
minggu sampai 3 minggu yang positif menderita kolibasilosis
dengan gejala diare putih yang diambil dari peternakan babi
pembibitan intensif.
PERALATAN
• Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini, antara lain cawan
petri, tabung reaksi dan raknya, osse, needle, inkubator, gelas ukur,
gelas beaker, stirrer cawane hot, magnetic heater stirrer, autoclave,
api bunsen, timbangan, termos es, spuite 1 cc, pinset, cotton bud.
Bahan – bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah alkohol
70%, larutan pepton 10%, media Mueller – Hinton Agar (MHA),
Eosin Methylin Blue Agar (EMBA), paper disk dengan kandungan
antibiotika oksitetrasiklin, streptomisin, kanamisin dan gentamisin.
PERSIAPAN BAHAN
• Media EMBA (Oxoid®), Muller Hinton Agar (Oxoid®) dan
paper disk (Oxoid®) dengan kadungan oksitetrasiklin,
streptomisin, kanamisin dan gentamisin disiapkan dalam
keadaan steril.
• Isolat diperoleh dari tinja anak babi yang menderita mencret
putih. Dilakukan diagnosa laboratorium yaitu melakukan
isolasi dan identifikasi kuman. Pengambilan spesimen
dilakukan memakai kapas bertangkai (cotton swab) dengan
memasukkan langsung pada rectum penderita, kemudian
dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril yang sudah berisi
larutan pepton dan dimasukkan ke dalam termos berisi es.
PEMBUATAN BAHAN
• Mueller Hinton Agar (MHA)
• Serbuk Mueller Hinton (Oxoid®) Agar 6,8 gram dilarutkan ke dalam
200 ml aquades ditabung Erlenmayer. Panaskan, aduk rata di atas
Stearer Hot Cawane sampai homogen. Lakukan sterilisasi di dalam
autoclave mencapai suhu 120oC dengan tekanan 15 p.s.i selama 15
menit lalu didinginkan sampai suhu 60oC. Kemudian tuang ke dalam
cawan petri sebanyak 15 ml, dinginkan sampai mengeras. Kemudian
ke dalam inkubator dengan posisi terbalik dengan tutup petri terletak
di bawah pada suhu 37oC selama 24 jam untuk uji sterilitas.
• Larutan Pepton 10 %
• Larutan pepton 10 % disiapkan, kemudian dipanaskan sambil diaduk
sampai homogen kemudian disterilkan dalam Autoclave pada suhu
121oC selama 15 menit, selanjutnya digunakan sebagai media
pertumbuhan bakteri untuk dicocokkan dengan standart Mc Farland
0,5.
PROSEDUR PENELITIAN ISOLASI DAN IDENTIFIKASI
KUMAN ESCHERICHIA COLI
• Spesimen yang berupa swab rectal dari babi muda yang
dicurigai menderita kolibasilosis dengan gejala menciri diambil
dengan menggunakan ossa yang steril dan langsung diusapkan
pada permukaan media. Pemupukan dilakukan pada media
EMBA kemudian diinkubasikan pada suhu 37oC selama 24
jam.
PROSEDUR PENENTUAN KEMAMPUAN DAYA
HAMBAT PERTUMBUHAN ESCHERICHIA COLI
STANDAR KIRBY-BAUER.

Cara kerja penanaman isolat E. coli pada Mueller Hinton Agar

pada cawan petri adalah sebagai berikut:
• Inokulasi 2 – 3 koloni kuman E. coli murni dari anak babi
yang menderita kolibasilosis kemudian dipupuk ke dalam 4 ml
perbenihan cair (dalam uji ini digunakan larutan pepton 10%).
• Inkubasi perbenihan tersebut pada suhu 37oC selama 2 – 8 jam
sampai terlihat adanya kekeruahan.
• Kekeruhan yang tampak disesuaikan dengan standar kekeruhan
dari Max Farland 0,5 yang setara dengan kandungan kuman
1x108 CFU/ml (Coloni Forming Unit)
• Sespensi kuman kemudian dituangkan ke dalam media Muller
Hinton Agar sebanyak 0,5 ml dan diratakan dengan
menggunakan gelas batang bengkok pada seluruh permukaan
media tersebut.
• Biarkan sampai 15-30 menit
• Tempelkan paper disk dengan pinset steril pada permukaan
media, jarak antara paper disk dengan paper disk yang lain 2
cm dan 2 cm dari tepi plate.
• Inkubasikan pada inkubator 37oC selama 18 – 24 jam.
• Amati hasil dan ukur diameter menggunakan jangka sorong.
• cocokan besarnya diameter daya hambat yang yang sudah
diukur dengan jangka sorong (satuan mm) dengan tabel
penentuan senstivitas antibiotik standar Kirby-bauer.
HASIL DAN PEMBAHASAN

• Hasil Isolasi dan Identifikasi Escherhicia coli. Hasil pemeriksaan feses

babi penderita kolibasilosis umur 1 – 3 minggu yang di tandai dengan
gejala diare berwarna putih diambil dari peternakan babi pembibitan
intensif dengan menggunakan cotton swab. Pertumbuhan kuman E. coli
pada EMBA koloni tampak berwarna hijau metalik dengan pusat koloni
hitam.

• Dari tabel diatas dapat dilihat bahwa kuman E. coli sebagai penyebab
kolibasilosis pada babi muda yang dipelihara secara intensif
menunjukkan bahwa dari kesepuluh anak babi yang diperiksa ternyata
kesepuluh anak babi (100%) resisten terhadap antibiotik oksitetrasiklin
dan streptomisin.
KESIMPULAN

• Kuman E. coli sebagai penyebab kolibasilosis pada babi muda

menunjukkan 100 % resisten terhadap antibiotik oksitetrasiklin
dan streptomisin.
• Streptomisin merupakan antibiotik yang menghambat
pertumbuhan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif.
Streptomisin terbagi atas dua jenis, yaitu Streptomisin A dan
Streptomisin B.
• Streptomisin memiliki tingkat toksisitas yang rendah dan dapat
digunakan untuk mengatasi infeksi yang resisten terhadap
penisilin. Hasil fermentasi bakteri Streptomyces griceus tidak
hanya menghasilkan streptomisin, tetapi juga mnghasilkan zat
lain seperti mannosidostreptomisin (Streptomisin B), serta
beberapa enzim ekstraseluler dan inhibitor.
Pemurnian dengan Karbon Aktif
• Streptomisin dapat diperoleh dari kaldu hasil fermentasi setelah
melalui berbagai tahap pemisahan dan pemurnian. Cara yang
dapat digunakan untuk mendapatkan streptomisin dari kaldu
hasil fermentasi adalah menggunakan bantuan karbon aktif.

Proses pemurnian yang digunakan adalah sebagi berikut:

• Adsorpsi dengan karbon aktif dilakukan pada pH 6 – 8 dengan
penambahan 1 – 2 % (v/v) asam fosfat
• Readsorpsi eluat dari karbon aktif pada pH 7
• Elusi dengan acidified methanol
• Evaporasi pada tekanan rendah
• Presipitasi streptomisin dengan penambahan aseton pada eluat
Pemurnian dengan Karbon Aktif pada Asam
• Pada metode ini, larutan streptomisin yang ingin dimurnikan
diproses pada kondisi asam (pH 1 – 4) dengan karbon aktif.
Dengan metode ini, pengotor seperti pirogen akan teradsorp ke
permukaan karbon aktif sementara streptomisin tetap tertinggal di
dalam larutan.

• Pada larutan yang telah diasamkan, ditambahkan sebanyak 1 – 5%

(% berat) karbon aktif, lalu aduk selama 15 menit. Kemudian
difiltrasi dan dibilas dengan air (sebanyak ¼ volume larutan awal).
Cake yang terbentuk lalu dibuang. Filtrat yang terbentuk diatur
hingga mencapai pH 6,6 dengan menambahkan 30% natrium
hidroksida. Endapan yang terbentuk pada proses ini dipisahkan
dengan filtrasi. Kemudian ditambahkan sebanyak 1 – 5% karbon
aktif ke dalam filtrat yang dihasilkan. Streptomisin akan teradsorp
ke dalam karbon aktif. Karbon aktif selanjutnya dibilas dengan air
atau alkohol lalu tambahkan metanol/etanol untuk membentuk
slurry dan dilanjutkan dengan filtrasi.
Pemurnian dengan Karbon Aktif pada Basa
• Proses ini pada pH 8 -11 dengan bantuan karbon aktif . Proses
selanjutnya adalah menyaring adsorbat karbon aktif-streptomisin,
membilas cake sampai netral, lalu mengelusi streptomisin dari karbon
aktif menggunakan asam mineral maupun asam alifatik lemah.

• Sebanyak 1- 5% (% berat) karbon aktif ditambahkan ke dalam larutan

dan dilakukan pengadukan. Kemudian adsorbat dibilas dengan air
sampai mencapai pH 7 -7,5. Volume air yang digunakan sekitar ¼
volume filtrat. Kemudian direaksikan dengan alkohol alifatik lemah,
difiltrasi, dan dielusi dengan mengatur pH mencapai 2 - 3 melalui
penambahan mineral nonoksidatif yang kuat seperti HCl. Karbon aktif
kemudian difiltrasi dan filtrat yang dihasilkan dipekatkan dengan
pemanasan pada temperatur 50ºC. Jika pada proses elusi digunakan
asam mineral maka sebelum dipekatkan larutan harus dinetralkan
terlebih dahulu. Hal ini dapat dilakukan dengan penambahan asam
maupun melewatkan larutan pada resin penukar ion. Kemudian
dilarutkan dalam metanol dan ditambahkan aseton untuk memebentuk
endapan streptomisin. Rasio aseton terhadap metanol yang digunakan
adalah 10 : 1 (perbandingan volume).
Resin Penukar Ion
• Resin penukar ion yang digunakan memiliki gugus asam
karboksilat. Resin jenis ini dapat menghasilkan streptomisin
dengan tingkat kemurnian yang cukup tinggi. Resin ini juga
memiliki selektivitas yang tinggi terhadap streptomisin
dibandingkan dengan zat lain yang terdapat dalam kaldu
fermentasi.
• Streptomisin dipisahkan dari kaldu fermentasi dengan
mengalirkan kaldu fermentasi melewati resin penukar ion.
Kemudian resin dicuci dengan asam dan diregenerasi dengan
basa untuk digunakan kembali pada proses selanjutnya.
Kolom Kromatografi
• Proses adsorpsi dilakukan dalam kolom kromatografi.
Adsorben yang dapat digunakan cukup beragam, dimulai dari
karbon aktif, acidwashed charcoal, alumina, dan acidwashed
alumina. Adsorben kemudian disusun dalam kolom
kromatografi dengan jumlah sekitar 10 – 30 gram adsorben
untuk setiap gram garam antibiotik yang akan diproses. Pelarut
yang hendak digunakan untuk proses elusi dimasukkan ke
dalam kolom dan dibiarkan sampai tersisa sekitar 1 – 2 mm
lapisan pelarut.
Ekstraksi Pelarut
• Streptomisin dapat dipisahkan dari komponen lain dalam
hasil fermentasi dengan mengubah bentuknya menjadi garam
karboksilat. Hal ini dilakukan dengan menambahkan natrium,
kalium, maupun amonium ke dalam kaldu hasil fermentasi.
Kemudian diekstraksi dengan pelarut organik seperti alkohol
beratom karbon 4 – 6. Ekstrak alkohol kemudian dibilas
dengan air atau larutan logam alkali halida untuk menghasilkan
garam streptomisin yang terlarut dalam alkohol.
Kesimpulan
• Metode yang paling umum digunakan dalam permurnian
streptomisin adalah pemanfaatan karbon aktif sebagai
adsorben. Untuk meningkatkan perolehan streptomisin, maka
penggunaan karbon aktif dapat dilakukan pada suasana asam
maupun basa sehingga diperoleh pengingkatan perolehan
streptomisin sebesar 50 – 60% dari metode konvensional.
• Minyak atsiri kemangi memiliki aktivitas antibakteri terhadap
Salmonella thypi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
efek antibakteri kombinasi streptomisin atau amoksisilin
dengan minyak atsiri kemangi terhadap bakteri Salmonella
thypi. Dipilihnya Salmonella typhi sebagai bakteri uji karena
bakteri ini dapat menyebabkan demam tifoid yang angka
kejadiannya cukup tinggi di Indonesia.
• Streptomisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida,
antibiotik ini bekerja dengan cara menghambat sintesis protein
Kombinasi antara antibiotik dan tanaman tradisional dapat
bermanfaat (bersifat sinergis atau interaksi secara adisi) atau
merusak (bersifat antagonis atau beracun) pada terapi
antibakteri.
Alat dan Bahan
• Alat :
• Alat yang digunakan dalam penelitian adalah seperangkat alat
destilasi, kompor gas, autoklaf (My Life), oven (Memmert), alat-alat
gelas (Iwaki-pyrex), LAF (Laminar Air Flow) (Astari Niagara),
neraca analitik (Precisa), vortex (Thermolyne Corporation),
inkubator (Memmert), shaker (New Brunswick Scientific).
• Bahan :
• Bahan yang digunakan adalah tangkai dan daun kemangi segar,
akuades, bakteri Salmonella thypi, disk antibiotik amoksisillin, disk
antibiotik streptomisin, disk kosong, media BHI (Brain Heart
Infusion) (Oxoid), media MH (Mueller Hinton) (Oxoid), media KIA
(Kligler Iron Agar) (Oxoid), media LIA (Lysine Iron Agar) (Oxoid),
media MIO (Motility Indol Ornithine) (Mereck), larutan salin (NaCl)
(Otsuka), cat Gram A, cat Gram B, cat Gram C, cat Gram D, standar
Mc. Farland (1,5x108 CFU/mL).
Determinasi Tanaman
• Determinasi ini bertujuan untuk memastikan bahwa tanaman
yang digunakan adalah tanaman kemangi.

Penyiapan Bahan
• Daun dan tangkai kemangi dipisahkan dari bagian lainnya,
kemudian dicuci bersih dengan menggunakan air mengalir,
ditiriskan, diangin-anginkan, dan dipotong-potong.
Ekstraksi Minyak Atsiri
• Ekstraksi minyak atsiri dilakukan dengan metode destilasi uap
dan air. Herba kemangi yang sudah dicuci bersih diletakkan di
atas angsang yang terletak beberapa sentimeter di atas
permukaan air dalam ketel penyulingan dan dihubungkan
dengan pendingin. Kompor dinyalakan untuk memanaskan
ketel dan air dialirkan dari kran ke alat pendingin. Suhu diatur
sedemikian rupa sehingga destilat yang keluar dapat menetes
dengan teratur. Minyak yang keluar ditampung, destilasi
diakhiri ketika volume minyak atsiri sudah tidak bertambah,
kemudian minyak atsiri dipisahkan dari air dengan corong
pisah dan disaring dengan natrium sulfat anhidrat yang telah
dioven selama 1 jam pada suhu 100ºC. Minyak atsiri yang telah
diperoleh disimpan dalam wadah yang tertutup rapat,
terlindung dari cahaya.
Preparasi media
• Dilakukan dengan cara melarutkan media dalam akuades sesuai
dengan instruksi yang terdapat pada masing-masing kemasan.
Kemudian disterilisasi dalam autoklaf 121ºC selama lebih kurang 20
menit, setelah itu media dituang sebanyak 20 mL dalam cawan petri
dan didiamkan pada suhu kamar hingga memadat.

Pembuatan Suspensi Bakteri

• Bakteri Salmonella thypi diambil dengan ose steril digoreskan secara
streak plate pada media agar MH (Mueller Hinton), kemudian
diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Koloni bakteri Salmonella
thypi yang tumbuh disimpan pada suhu 4ºC. Kemudian mengambil
koloni bakteri dari biakan bakteri pada media padat MH (Mueller
Hinton) ke dalam 2 ml BHI cair, menghomogenkan dengan
menggunakan shaker ± 2 jam kemudian disamakan dengan standar
Mc. Farland (1,5x108 CFU/mL) sampai mempunyai kekeruhan yang
sama.
Uji Aktivitas Antibakteri
• Cawan petri steril diisi 20 mL media MH (Mueller Hinton) dan
didiamkan kurang lebih 20 menit sampai memadat. Suspensi
bakteri dengan konsentrasi 1,5 x 108 CFU/mL sebanyak 300
μL dituangkan di atas media MH (Mueller Hinton) yang telah
memadat dan diratakan menggunakan spreader glass steril,
didiamkan selama 3-15 menit. Disk minyak atsiri 15 μL/disk
bersama dengan disk streptomisin atau amoksisilin diletakan
pada media MH (Mueller Hinton) secara sejajar.
• Jarak antara disk minyak atsiri dan antibiotik adalah
penjumlahan dari diameter zona hambat minyak atsiri yang
diperoleh dari uji pendahuluan dan diameter zona hambat
antibiotik yang didapat dari uji sensitifitas. Cawan petri
diinkubasi pada suhu 37ºC selama 18-24 jam, dengan posisi
tutup cawan di bawah dan tidak boleh ditumpuk lebih dari lima
cawan, selanjutnya diamati zona hambat.
Identifikasi Bakteri
• Berdasarkan hasil pengecatan Gram, Salmonella thypi
merupakan bakteri Gram negatif yang berwarna merah dan
berbentuk batang. Dinding sel bakteri Gram negatif banyak
mengandung lipopolisakarida. Perubahan warna merah ini
terjadi karena bakteri tersebut tidak tahan terhadap alkohol dan
mengikat cat Gram D (safranin). Warna cat bakteri Gram
negatif yang sebelumnya telah dilunturkan oleh cat Gram C
sehingga bakteri tidak berwarna lagi dan akan mengikat warna
cat gram D sehingga terlihat berwarna merah.
Uji Sensitivitas Antibakteri
• Uji sensitivitas bakteri dilakukan dengan metode difusi cakram
menggunakan berbagai antibiotik, yaitu streptomisin (S),
sefalotin (KF), trimetropim-sulfametoksazol (SXT),
amoksisilin (AML), amikasin (AK), dan gentamisin (CN).
• Berdasarkan hasil uji sensitifias Salmonella thypi, terdapat
zona hambat pada disk antibiotik streptomisin (S), sefalotin
(KF), trimetropim-sulfametoksazol (SXT), amoksisilin (AML),
amikasin (AK), dan gentamisin (CN) dengan diameter berturut-
turut 13 mm , 21 mm, 31,3 mm, 24 mm, 22 mm, dan 19,7 mm
sehingga dapat dinyatakan Salmonella thypi sensitif terhadap
antibiotik
Uji Pendahuluan
• Minyak atsiri kemangi dibuat seri konsentrasi 2,5%, 5%, 7,5%,
10%, 15%, 25%, 35%, 45% dalam pelarut etil asetat dan
minyak atsiri 100%. Masing-masing konsentrasi tersebut
dihasilkan zona hambat secara berturut-turut dari konsentrasi
terkecil 8,67 mm, 9 mm, 8,67 mm, 9,5 mm, 9,33 mm, 9,17
mm, 9,17 mm, 9 mm dan 11,5 mm. Zona hambat paling besar
adalah minyak atsiri kemangi murni.
Uji Aktivitas Antibakteri
• Hasil pengujian menunjukkan bahwa kombinasi amoksisilin atau
streptomisin dengan minyak atsiri kemangi mempunyai efek antibakteri
terhadap Salmonella thypi. Amoksisilin bersifat indifferent, hal ini ditandai
dengan zona yang dihasilkan pada kombinasi minyak atsiri kemangi dan
amoksisilin (24,25 mm) dengan zona yang dihasilkan oleh amoksisilin
tunggal (24 mm) tidak saling mempengaruhi, maksudnya pada penambahan
minyak atsiri kemangi ternyata zona yang dihasilkan tetap sama dengan
zona yang dihasilkanpada amoksisilin tunggal. Streptomisin bersifat
indifferent, hal ini ditandai dengan zona yang dihasilkan pada kombinasi
minyak atsiri kemangi dan streptomisin (12,75 mm) dengan zona yang
dihasilkan oleh streptomisin tunggal (13 mm) tidak saling mempengaruhi,
maksudnya pada penambahan minyak atsiri kemangi ternyata zona yang
dihasilkan tetap sama dengan zona yang dihasilkan pada streptomisin
tunggal. Aktivitas penghambatan bakteri ini ditunjukkan dengan adanya
zona radikal (bening) di sekitar disk.
• Dari hasil yang didapatkan dalam penelitian ini menunjukkan efek
indifferent pada kombinasi antara minyak atsiri kemangi dengan kedua
antibiotik (amoksisilin atau streptomisin). Efek indifferent yang berarti
kedua zona hambat tidak saling berhubungan.
KESIMPULAN

• Aktivitas antibakteri kombinasi amoksisilin atau streptomisin

dengan minyak atsiri
• kemangi terhadap Salmonella thypi bersifat indifferent.