Analisis Akrilamida

Analisis Akrilamida dan Glisidamida dalam Dried
Blood Spots Pelajar dengan Kromatografi Cair

Kinerja Ultra Tinggi Tandem Spektrometri Massa
Pembimbing:
Prof. Dr. Yahdiana Harahap, M.S., Apt.
dr. Sunarsih
Wiwin Widayanti
1506727816
Praseminar Fakultas Farmasi Universitas Indonesia 2019

Latar Belakang
Dicirikan dengan Menginvasi
pertumbuhan sel-sel dan
Kanker yang abnormal menyebar
melebihi batas ke organ
biasanya lainnya
18,1 juta kasus baru kanker di dunia

pada tahun 2018
Menyebabkan 9,6 juta kematian pada

tahun 2018
Prevalensi kanker di Indonesia pada tahun 2013 yaitu

1,4 per 100 penduduk

30-50% dari kematian akibat kanker
dapat dicegah dengan mengubah
atau menghindari faktor risiko utama
Menghindari rokok
Mengonsumsi makanan sehat
Menghindari radiasi dan karsinogen
Berolahraga secara teratur
Menjaga berat badan
Mengatasi faktor risiko terkait infeksi

Akrilamida
Ditemukan dalam makanan dengan kandungan karbohidrat

tinggi yang dimasak pada suhu di atas 120°C
Terbentuk melalui degradasi termal asparagin dengan

adanya gula pereduksi dalam reaksi Maillard
Sudah pasti bersifat genotoksik dan karsinogenik pada

hewan
Diklasifikasikan oleh IARC ke dalam grup 2A

Biotransformasi Akrilamida

Keunggulan
DBS: Mudah dilakukan
Tidak invasif
Analit menjadi lebih stabil
Penyimpanan dan distribusi mudah
Volume sampel yang dibutuhkan

sedikit
Tujuan Penelitian
Melakukan analisis akrilamida dan

glisidamida serta propanamida
sebagai baku dalam secara simultan
dalam DBS pelajar
Melakukan penilaian terhadap

paparan akrilamida pada pelajar yang
terjadi akibat mengonsumsi makanan
yang mengandung akrilamida

Metodologi Penelitian
Analisis Akrilamida dan Glisidamida dalam Dried Blood

Spots Pelajar dengan Kromatografi Cair Kinerja Ultra Tinggi
Tandem Spektrometri Massa

Alat :
Seperangkat alat kromatografi cair kinerja ultra tinggi tandem
spektrometri massa (Waters Xevo TQD Triple Quadrupole) :
- Quartenary Solvent Manager (Acquity UPLC H-Class)
- Sample Manager (Acquity UPLC)
- Nitrogen generator compressor (PEAK Scientific)
- Kolom Acquity UPLC BEH C18 (2,1 × 100 mm) 1,7 μm (Waters)
- Mass analyzer berupa triple quadrupole (Xevo TQD)
- Sumber ionisasi (ZsprayTM)
Perangkat lunak pengolah data dan komputer, microtube 1,5 mL,

vial autosampler, timbangan analitik, evaporator, lemari pendingin
4°C, alat sentrifugasi, vortex, mikropipet Eppendorf, blue tip, yellow
tip, white tip, dan alat-alat gelas

Bahan Uji
• Sampel DBS yang diperoleh • Kriteria eksklusi:
dari 30 pelajar 1. Seorang perokok aktif atau
• Kriteria inklusi: pasif
1. Pelajar yang berusia 7-18 2. Tidak atau sedikit
tahun mengonsumsi makanan yang
2. Bukan seorang perokok aktif mengandung akrilamida
dan pasif
3. Banyak mengonsumsi
makanan yang mengandung
akrilamida, seperti keripik
kentang, kentang goreng,
pop corn, sereal, biskuit, kopi
instan

Kontrol Negatif
• Sampel DBS yang diperoleh • Kriteria eksklusi:
dari 30 orang subjek sehat 1. Seorang perokok aktif atau
• Kriteria inklusi: pasif
1. Pelajar yang berusia 7-18 2. Mengonsumsi makanan
tahun yang mengandung
2. Bukan seorang perokok akrilamida selama 48 jam
aktif dan pasif sebelum penelitian dan
3. Bersedia tidak selama periode
mengonsumsi makanan pengambilan sampel
yang mengandung darah
akrilamida selama 48 jam
sebelum penelitian dan
selama periode
pengambilan sampel
darah
Bahan Kimia Bahan Pengambilan Sampel
• Akrilamida • Kertas DBS
• Glisidamida • Alcohol swab
• Propanamida • Lanset
• Asam formiat
• Asetonitril
• Metanol
• Aqua bidestilata
• Darah

Akrilamida Glisidamida
Rumus Molekul : C3H5NO Rumus Molekul : C3H5NO2
Berat Molekul : 71,08 g/mol Berat Molekul : 87,078 g/mol
Kelarutan : larut dalam 215,5 g/100 Kelarutan : Sedikit larut dalam
mL air; 15,5 g/100 mL metanol; 66,2 metanol, sedikit larut dalam etil
g/100 mL etanol asetat
Baku dalam : Propanamida

Rumus Molekul : C3H7NO
Berat Molekul : 73,095 g/mol
Kelarutan : Sangat mudah larut dalam air,
mudah larut dalam alkohol
Sumber : National Center for Biotechnology Information, 2005; National Toxicology Program, 2004

ALUR KERJA
Pembuatan Larutan
Uji Kesesuaian Sistem
Preparasi Sampel Akrilamida dan

Glisidamida dalam DBS
Validasi Parsial Metode Bioanalisis
Pengambilan dan Preparasi Sampel DBS

Anak Sekolah dan Subjek Kontrol Negatif

Pembuatan Larutan Induk
Akrilamida 10 mg Glisidamida 10 mg Propanamida 10 mg
Ad aqua Ad aqua Ad aqua

bidestilata bidestilata bidestilata
10 ml 10 ml 10 ml
1000 ppm 1000 ppm 1000 ppm
Larutan Stok Standar Larutan Stok Baku Dalam
Pengenceran dilakukan untuk mendapatkan larutan dengan

konsentrasi tertentu

Pembuatan Fase Gerak
Larutan Fase Gerak A Larutan Fase Gerak B
(metanol 5% dalam asam (asetontitril 100%)
formiat 0,1% v/v)
Metanol 5% Asetonitril 100%
Ad Asam
formiat 0,1%
100 ml
Larutan fase gerak akhir diperoleh dengan mencampurkan larutan

fase gerak A dan B (98:2 v/v) ke dalam botol fase gerak,
homogenkan dan hilangkan gelembung udara (degasser)

Pembuatan Larutan Standar Kurva Kalibrasi
Larutan induk Larutan induk

akrilamida 1000 ppm glisidamida 1000 ppm
Ad asetonitril Ad asetonitril
Larutan standar Larutan standar

akrilamida 10 ppm glisidamida 10 ppm
Ad darah Ad darah
Rentang KK : 10-5000 Rentang KK : 15-5000

ng/mL ng/mL
Kurva kalibrasi dibuat dengan rentang tersebut di atas dengan minimal
6 titik konsentrasi, zero sample dan blank sample

Pembuatan Larutan Sampel Kualitas Kontrol
QCH = 75% × ULOQ
= 75% × 5000 ng/mL = 3750 ng/mL
QCM = 40% × rentang kalibrasi
Rentang KK
= 40% × 5000 ng/mL = 2000 ng/mL
akrilamida 10-5000
ng/mL QCL = 3 × LLOQ
= 3 × 10 ng/mL = 30 ng/mL
QCH = 75% × ULOQ

= 75% × 5000 ng/mL = 3750 ng/mL
Rentang KK glisidamida 15- QCM = 40% × rentang kalibrasi
5000 ng/mL = 40% × 5000 ng/mL = 2000 ng/mL
QCL = 3 × LLOQ
= 3 × 15 ng/ml = 45 ng/ml
Larutan induk untuk sampel kualitas kontrol akrilamida dan glisidamida

disiapkan terpisah dari larutan induk untuk kurva kalibrasi

Kondisi Analisis
• Kondisi sistem kromatografi:
 Fase gerak: campuran larutan A dan B (98:2 v/v)
Larutan fase gerak A: metanol 5% dalam asam formiat
0,1% v/v
Larutan fase gerak B: asetonitril 100%
 Tipe elusi: gradien
 Laju alir: 0,1 mL/menit
 Suhu kolom: 30°C
 Volume injeksi: 10 µL

Kondisi Analisis
 Profil elusi fase gerak:
Menit ke- Fase Gerak A (%) Fase Gerak B (%)
0,00 30 70
1,00 70 30
3,00 98 2
6,00 98 2
9,00 70 30

Kondisi Analisis
• Kondisi sistem spektrometri massa:
 Sumber electrospray ionization: mode ESI positif (+)
 Deteksi sampel: mode multiple reaction monitoring (MRM)
 Waktu tinggal (dwell time) 200 ms per saluran MRM
 Suhu gas: 300°C
 Laju gas: 10L/menit
 Tekanan nebulizer gas: 20 psi
 Transisi MRM: m/z 71,9  55,0 untuk akrilamida dan m/z 87,9 
44,2 untuk glisidamida
 Energi tumbukan: 2V (akrilamida) dan 5V (glisidamida)

Uji Kesesuaian Sistem
Larutan campuran akrilamida, glisidamida dan propanamida dengan
konsentrasi 10 ppm disuntikkan sebanyak 10 µL ke dalam alat
KCKUT-SMSM dengan kondisi optimum yang telah diperoleh
• Dilihat KV dari luas puncak dan waktu retensi yang dihasilkan

dari analit dan baku dalam
• Uji kesesuaian sistem dilakukan dengan enam kali pengulangan
dengan syarat KV tidak melebihi 6%
• Uji kesesuaian sistem dilakukan setiap kali sebelum
melakukan analisis setiap hari dengan tujuan untuk melihat
kondisi analisis yang akan digunakan apakah sudah memenuhi
persyaratan sehingga siap digunakan untuk proses validasi

Preparasi Sampel Akrilamida dan
Glisidamida dalam DBS
Larutan induk akrilamida (1000 ppm) dan
glisidamida (1000 ppm) masing-masing sebanyak 1
µL dipipet dan dimasukkan ke dalam sample cup
Darah utuh sebanyak 1999 µL ditambahkan ke

dalam sample cup sehingga diperoleh campuran
sampel dengan konsentrasi masing-masing 500
ng/mL
Ekstraksi

Metode Ekstraksi
Bagian supernatan diambil
Darah yang mengandung
sebanyak 100 µL lalu
akrilamida dan glisidamida Vorteks 3 menit, sonikasi
ditambahkan pelarut
ditotolkan pada kertas DBS selama 5 menit pada suhu
pengekstraksi, yaitu
(volume penotolan 25 µL; 25°C
asetonitril-etil asetat (1:2)
waktu pengeringan 2 jam)
sebanyak 300 µL
Kertas dipotong, dipreparasi Sonikasi 5 menit, sentrifugasi Sentrifugasi pada 12000 rpm
dengan dimasukkan ke dalam pada 16.060g selama 10 selama 5 menit pada suhu
microtube menit 25°C
Ditambahkan larutan baku Fase organik didekantasi dan Sampel yang diresuspensi
dalam propanamida (1 Vorteks 1 menit dipindahkan ke tube yang sebanyak 10 µL disuntikkan
µg/mL) sebanyak 20 µL lain ke dalam KCKUT-SM/SM
Tambahkan aqua bidestilata-

Ditambahkan 200 µL Uapkan pada suhu 40°C
Vorteks 20 detik metanol-asetonitril (60:32:8
metanol dengan aliran udara
v/v/v) sebanyak 200 µL

Validasi Parsial Metode Bioanalisis
Minimal 6 titik konsentrasi +

1 blanko + 1 zero Syarat : %diff ≤ 15% pada
Kurva Kalibrasi  (5-5000 ng/mL untuk  semua konsentrasi, kecuali
akrilamida dan 10-5000 %diff LLOQ ≤ 20%
ng/mL untuk glisidamida)
Membuat 5 replika pada
Akurasi dan Syarat : %diff & %KV LLOQ ≤
konsentrasi LLOQ, QCL, QCM,
Presisi Intra   20% dan %diff & %KV lain ≤
QCH secara intra hari
Hari 15%
(within-run)
Sampel dipreparasi pada kertas DBS dan larutan hasil preparasi sebanyak 10
µL disuntikkan ke dalam KCKUT-SM/SM sesuai dengan kondisi analisis hasil
optimasi

Pengambilan Sampel DBS Pelajar
dan Subjek Kontrol Negatif
Sampel darah subjek
diambil sebanyak ±300
µL dengan teknik finger
prick menggunakan
lanset steril
Darah dikumpulkan
pada microtube dan
ditotolkan pada kertas
DBS Perkin Elmer 226
sebanyak ±25 µL
Biarkan hingga kering

selama 2 jam pada
suhu ruang

Preparasi dan Penetapan Kadar Sampel DBS
Kertas dipotong, dipreparasi Vorteks 3 menit, sonikasi Sentrifugasi pada 12000 rpm
dengan dimasukkan ke dalam selama 5 menit pada suhu selama 5 menit pada suhu
microtube 25°C 25°C
Bagian supernatan diambil

sebanyak 100 µL lalu
Ditambahkan larutan baku Fase organik didekantasi dan
ditambahkan pelarut
dalam propanamida (1 dipindahkan ke tube yang
pengekstraksi, yaitu
µg/mL) sebanyak 20 µL lain
asetonitril-etil asetat (1:2)
sebanyak 300 µL
Sonikasi 5 menit, sentrifugasi

Uapkan pada suhu 40°C
Vorteks 20 detik pada 16.060g selama 10
dengan aliran udara
menit
Tambahkan aqua bidestilata- Sampel yang diresuspensi

Ditambahkan 200 µL
Vorteks 1 menit metanol-asetonitril (60:32:8 sebanyak 10 µL disuntikkan
metanol
v/v/v) sebanyak 200 µL ke dalam KCKUT-SM/SM

Rencana Penelitian
Analisis Akrilamida dan Glisidamida dalam Dried Blood

Spots Pelajar dengan Kromatografi Cair Kinerja Ultra Tinggi
Tandem Spektrometri Massa

Jadwal Penelitian


Analisis Akrilamida

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Analisis Akrilamida

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

Analisis Akrilamida dan Glisidamida dalam Dried

Blood Spots Pelajar dengan Kromatografi Cair

Praseminar Fakultas Farmasi Universitas Indonesia 2019

18,1 juta kasus baru kanker di dunia

Menyebabkan 9,6 juta kematian pada

Prevalensi kanker di Indonesia pada tahun 2013 yaitu

Praseminar Fakultas Farmasi Universitas Indonesia 2019

Mengonsumsi makanan sehat

Menghindari radiasi dan karsinogen

Berolahraga secara teratur

Menjaga berat badan

Mengatasi faktor risiko terkait infeksi

Praseminar Fakultas Farmasi Universitas Indonesia 2019

Ditemukan dalam makanan dengan kandungan karbohidrat

Terbentuk melalui degradasi termal asparagin dengan

Sudah pasti bersifat genotoksik dan karsinogenik pada

Diklasifikasikan oleh IARC ke dalam grup 2A

Praseminar Fakultas Farmasi Universitas Indonesia 2019

Praseminar Fakultas Farmasi Universitas Indonesia 2019

Analit menjadi lebih stabil

Penyimpanan dan distribusi mudah

Volume sampel yang dibutuhkan

Melakukan analisis akrilamida dan

Melakukan penilaian terhadap

Praseminar Fakultas Farmasi Universitas Indonesia 2019