Anda di halaman 1dari 16

ISOLASI DNA

METODE BOILING

Kelompok 4 :
Ayu Shinta Permana
P17334118053
Nada Shabira P17334118073
Fadhilah Shafa Ambarnisa P17334118064
Tira Kurniasih P17334118044
Pengertian Isolasi DNA
Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari
tempatnya berada (ekstraksi atau lisis), biasanya
dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer
ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak.

Tujuan utama isolasi DNA


Untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein,
lemak, dan karbohidrat.
3 Prinsip utama Isolasi DNA:

• Penghancuran (lisis)
• Ekstraksi atau pemisahan DNA dari bahan
padat seperti selulosa dan protein
• Pemurnian DNA.
Fungsi Isolasi DNA:

Isolasi DNA juga berfungsi sebagai media


pembelajaran genetik, dapat mengetahui
kelainan genetik yang di derita, dapat
mengetahui agen penyebab penyakit infeksi, dan
lain-lain. (Yuwono, 2006.; Soedjadi, 2008.;
Maftuchah, 2014)
Macam-macam metode isolasi DNA
1. Metode Boiling
Suhu tinggi setelah proses pelisisan sel akan mendenaturasi protein dan DNA,
namun tidak sanggup memisahkan kedua untai DNA pada struktur dobel heliks
sirkular plasmid
2. Teknik Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)
Berdasarkan pada amplifikasi dari segmen-segmen DNA acak yang
menggunakan primer tunggal yang sekuen nukleotidanya ditentukan secara
acak.
3. Metode CTAB
Menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari
polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differensial of
solubility)
4. Phenol-chloroform
Menggunakan senyawa phenol-chloroform-isoamyl alcohol. Metode
standard untuk ekstraksi DNA, akhir-akhir ini ditinggalkan karena sifat
toksik dari fenol.

5. Salting Out
Menggunakan garam konsentrasi tinggi (NaCl 6 M) untuk
mendenaturasi protein menggunakan proteinase K untuk denaturasi
protein.

6. Guanidine isothiocyanate
Thiocyanate bersifat toksik, untuk melisiskan dinding sel. Memerlukan
chloroform untuk denaturasi protein.
7. Silica Gel
Silica gel dapat mengikat DNA dengan perantaraan garam atau buffer tertentu (NaI).
Metode ini cepat tetapi recovery DNA kurang.

8. Polymerase Chain Reaction (PCR)


teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik
yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida.

9. Metode Alkaline Lisis


kondisi alkali yang disebabkan perlakuan dengan adonan SDS dan NaOH menjadikan
DNA kromosomal dan plasmid mengalami denaturasi setelah sel mengalami lisis.

10. Metode Reagen Kit


Secara umum tahapan yang dilakukan ialah persiapan sampel, lisis, pengikatan DNA,
pencucian DNA, dan elusi DNA.
Isolasi DNA metode Boiling
Fungsi:
• Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel.
• Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan
pustaka genomik.
• Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin
peminakan DNA.
• Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan
(template) dalam prosedur perbanyakan DNA secara in
vitro melalui teknik PCR.
Prinsip isolasi Boiling
Isolasi DNA plasmid dengan metode boiling memakai
prinsip bahwa suhu tinggi setelah proses pelisisan sel akan
mendenaturasi protein dan DNA, namun tidak sanggup
memisahkan kedua untai DNA pada struktur dobel heliks
sirkular plasmid.

Teknik isolasi plasmid tersebut disebabkan DNA


sirkular plasmid mempunyai topologi dua untai
polinukleotida sirkular yang saling berkaitan. Ketika suhu
diturunkan, plasmid akan mengalami renaturasi,
sedangkan DNA kromosomal yang menjadi linear setelah
proses pelisisan sel dan tetap terikat pada membran sel
Alat dan Bahan

Alat :
• Biosafety Cabinet
• Mikropipet 10, 200, dan Bahan :
1000 µl
1. PCR buffer / TE Buffer
• Mikrotube 200 dan 1500
µl 2. Proteinase K

• Mikrosentrifuse 3. Sampel (koloni / suspensi bakteri)


• Waterbath/ Thermal
Cycler
Prosedur kerja
• Tumbuhkan bakteri dalam media LB (Lactose Broth) dalam
waktu 12-24 jam suhu 37°C.
• Ambil sebanyak 250 µl dan masukkan ke dalam 0,5 / 1,5 mL
tabung Eppendorf.
• Sentrifuse 3000 rpm selama 5 menit, buang supernatan.
• Tambahkan 50 µl 1x PCR-buffer / TE Buffer.
• Tambahkan 1 µl Proteinase K (10 mg/mL).
• Bekukan minimal 1 jam pada -80°C agar jaringan sel rusak.
• Panaskan selama 1 jam pada 60°C dan didihkan selama 15
menit pada 95°C (dalam mesin PCR).
• Simpan suspensi DNA yang terbentuk pada -20°C atau dapat
digunakan langsung untuk PCR.
Kontaminan Isolat DNA
Tahap 1  proses perusakan atau
penghancuranmembran dan dinding sel.
Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari
isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan
isi sel.

Tahap 2  Proses lisis dengan menggunakan detergen,


menggunakan sodiumdodecyl
sulphate (SDS) sebagai tahap pelisisan membran
sel.
Kotoran akibat lisis sel dipisahkan dengan cara
sentrifugasi pada kecepatan sedang sekitar 3000-5000
rpm selama 5 hingga 10 menit.
Tahap 3  pemurnian DNA, yang betujuan untuk
menghilangkan beberapa kontaminan seperti
senyawa sekunder (fenol) polisakarida, 2NA dan
juga protein.
Pemurnian dari kontaminan protein dan RNA dilakukan
menggunakan senyawa kloroform isoamilalkohol, asam
asetat, dan enzim RNAse.
Kemudian molekul nukleotida (DNA dan RNA) yang
telah dipisahkan dibersihkan dari protein yang masih
ada dengan menggunakan fenol. Dalam proses ini
sebagian kecil RNA juga dapat dibersihkan. Sedangkan
kloroform digunakan untuk membersihkan sisa&sisa
protein dan polisakarida dari larutan. Proses
sentrifugasi dengan kecepatan tinggi akan mengendapkan
tepung berwarna putih (DNA) dan menempel di dasar
tabung ependorf.
Penyimpanan Isolat DNA

• Apabila ingin disimpan dalam waktu lama, larutan


DNA dapat disimpan dalam bentuk aliquot dalam suhu
-20°C atau -70°C.

• Untuk pemakaian sehari-hari, DNA dapat disimpan


pada suhu 4°C untuk beberapa bulan.