KROMATOGRAFI

(warna dan tulis)

SEJARAH: Tswett (1906)

- Melewatkan ekstrak daun melalui kolom yang berisi kalsium
karbonat.
- Terjadi pemisahan warna
 PENGELOMPOKKAN KROMATOGRAFI

Kromatografi: Suatu proses migrasi diferensial dimana komponen sampel

ditahan secara selektif oleh fasa diam

Berdasarkan fasa gerak:

•Kromatografi gas
•Kromatografi cairan

Kromatografi gas: Kromatografi cairan:

• GLC atau GC •LLC (kertas)
• GSC •LSC (cairan)
•CC (kolom)
•Penukar ion
KROMATOGRAFI GAS

Teknik memisahkan zat-zat yang mudah menguap berdasarkan migrasi

diferensial pada fasa gerak gas dan fasa diam (cairan berupa lapisan
pada zat padat pendukung)
Mekanisme pemisahan: partisi antara gas dan lapisan cairan fasa diam
Bagan alat:
Bagian-bagian terpenting

1. Gas pembawa (Carrier gas)

-Silinder gas bertekanan tinggi
-Dilengkapi dengan pengatur tekanan (agar konstan) dan laju aliran konstan
(Fc dalam mL/mnt)
-Pada suhu konstan, Fc yang konstan akan mengelusi komponen keluar
dalam jangka waktu yang karakteristik (waktu retensi)
-Karena Fc konstan, untuk elusi komponen diperlukan volum gas pembawa
yang karakteristik pula (volum retensi)

Syarat-syarat gas pembawa

•Inert, tak bereaksi dengan cuplikan atau fasa diam

•Mudah diperoleh/murni
•Tidak mahal
•Cocok dengan detektor yang digunakan
•Contoh: H2, He atau N2
 2. Injeksi cuplikan
•Menginjeksikan harus cepat
•Volum cuplikan yang masuk kolom dalam keadaan “plug”
•Alat injeksi: Syringe
Volum cairan: 0,2 – 20 mikroLiter
gas: 0,5 – 50 mikroLiter
•Jarum injeksi ditusukan dalam sumbat
(septum)

3. Kolom
•Bahan: Cu, baja tahan karat, Alumunium atau kaca
•Bentuk: lurus atau spiral
•Panjang kolom: Beberapa inci-50 feet
•Diameter kolom: 0,01 – 2 inci
 4. Zat padat pendukung
•Guna: untuk memberikan suatu permukaan yang luas, inert dan seragam
•Sifat: -inert
-tahan gilingan
-bentuk teratur
•Contoh : Chromosorb

5. Cairan fasa diam

•Harus melarutkan cuplikan
•Tidak boleh menguap pada suhu percobaan

6. Suhu
Suhu ruang injeksi
•Suhu ruang injeksi harus cukup tinggi untuk menguapkan cuplikan dengan cepat.
•Tidak menyebabkan cuplikan terurai
 Suhu kolom
•Harus cukup tinggi hingga waktu analisanya cepat
•Cukup rendah hingga dapat terjadi pemisahan yang baik

Suhu detektor
•Tergantung jenis detektor

7. Alat detektor
Detektor: mengukur jumlah banyaknya/ konsentrasi komponen didalam gas
pembawa.
Sifat-sifatnya:
- kepekaan tinggi
- tingkat noise rendah
- tidak peka terhadap perubahan suhu
Contoh: TCD= Thermal Conductivity Detector
FID = Flame Ionozation Detector.
 Keuntungan penggunaan alat GC
•Analisanya cepat
•Resolusi baik
•Analisa kualitatif
•Analisa kuantitatif
•Cukup peka
•sederhana

Faktor-faktor yang menentukan berhasilnya pemisahan

A. Retensi
B. Efisiensi kolom
C. Selektivitas kolom
D. Resolusi
E. Kapasitas cuplikan
A. Retensi
Penahanan komponen cuplikan oleh fasa diam dalam kolom
Besaran-besaran yang menentukan retensi:
1. Volum Retensi (VR)

Besarnya volum fasa gerak yang diperlukan untuk memindahkan

“puncak” suatu komponen sepanjang kolom
2. Waktu retensi (tR)
Waktu yang diperlukan oleh gas pembawa untuk membawa
komponen sepanjang kolom.

tR 0= waktu retensi udara

Hubungan antara volum dan waktu retensi

VR = Fc x tR FC = laju aliran gas pembawa dalam kolom

3. Faktor retensi (Rf ):

L L= panjang kolom
tR t0
Rf  
L tR
t0
4. Koefisien partisi (K)

CS CS= kons. Zat x pada fasa diam

K CM= kons. Zat x pada fasa gerak
CM

Faktor pemisahan

K1 K1=koef. Partisi komponen 1

 K2=koef. Partisi komponen 2
K2

Atau
tR2

t R1
5. Faktor kapasitas, k’

C SVS t R  t0
k' atau k'
C MVM tR
B. Efisiensi kolom
Melebarnya puncak X pada waktu gerakannya
sepanjang kolom

Bentuk kromatogram:

1. Kromatogram linear dan ideal

puncak-puncaknya sangat sempit

2. Kromatogram linear dan tak ideal

bentuk simetris (linear) dan puncak melebar (tak ideal)

3. Kromatogram tak linear dan tak ideal

-puncak mengekor (peak tailing)
-puncak memimpin (peak leading)
Besaran-besaran yang merupakan ukuran efisiensi kolom

•Teori pelat (Martin Synge-1941)

Kolom kromatografi di bayangkan terdiri dari bagian-bagian tipis
yang disebut ‘pelat teori’ (theoritical plate)
•Dianggap bahwa dalam setiap pelat teori kolom kromatografi
terjadi kesetimbangan distribusi (partisi) komponen X antara
fasa gerak dan fasa diam

a. Semakin banyak jumlah pelat teori (N) suatu kolom

kromatografi semakin baik kemampuan untuk
memisahkan atau itu yang disebut efisien kolom.

N = ukuran efisiensi kolom

N dihitung berdasarkan

2
 tR 
2  tR 
N  16  N  5,54 
 w1 2 
w  
b. HETP (Height equivalent of a theoritical plate)
atau Tinggi pelat teori

L
HETP  L=panjang kolom
N N=jumlah plat teori

Cat: Kolom yang efisien jika N banyak (besar)

dan HETP kecil
Faktor-faktor Yang memperbesar HETP

B
HETP  A   C.u
u
A = suku difusi Eddy (efek jalur ganda)
B/u = suku difusi longitudinal (gerakan longitudinal)
C = efek perpindahan massa (tidak tercapainya kesetimbangan
distribusi
u = kecepatan gas pembawa/kec.alir
1. Suku A dari pers. V.D (efek jalur ganda)
Ket:
1. Panjang jalur-jalur gerakan molekul-molekul komponen dari
lubang masuk keluar kolom tidak sama
2. Variasi panjang jalur semakin besar bila partikel isi kolom
berdiameter besar + berbeda bentuk

Akibatnya molekul-molekul yang bergerak pada waktu bersamaan

pada lubang masuk kolom, tibanya pada lubang keluar tidak
bersamaan sehingga terjadi pelebaran puncak atau
pembesaran HETP
 2. Suku B/u
Pelebaran puncak (pembesaran H) yang disebabkan oleh
gerakan difusi longitudinal dari molekul komponen (searah
dengan panjang kolom)

u <<< , B/u >>> maka H >>> (puncak semakin besar)

 2. Suku B/u
Pelebaran puncak (pembesaran H) yang disebabkan oleh
gerakan difusi longitudinal dari molekul komponen (searah
dengan panjang kolom)

u <<< , B/u >>> maka H >>> (puncak semakin besar)

 3. Suku C.u= efek perpindahan massa

Bertambah lebarnya puncak kromatogram disebabkan karena tidak

tercapainya kesetimbangan partisi (distribusi) pada perpindahan
massa komponen cuplikan antara fasa gerak dan fasa diam)

Penyebab:
-komponen yg harus terdistribusi antara kedua fasa bergerak terus
menerus bersama gas pembawa (tidak berhenti dulu disetiap pelat
teori untuk mencapai kesetimbangan)
-molekul komponen yg sudah ada di cairan fasa diam tidak cukup
cepat untuk mendifusi ke perbatasan antara fasa cair dan gas.
Cara-cara memperkecil HETP

1. Suku A (Kolom):
-ukuran partikel isi kolom kecil
-semakin seragam geometri partikel
-semakin kecil diameter kolom
2. Suku B (sampel dan gas pembawa)
-u makin besar (optimum)
-berat mol gas pembawa
-digunakan tekanan lebih besar
3. C.u (jenis, tekanan dan kec.alir gas pembawa)
digunakan cairan fasa diam lebih tipis
C. Selektivitas kolom

Kemampuan kolom kromatografi untuk membedakan antara 2

buah komponen cuplikan atau lebih sehingga komponen tersebut
dapat terpisah dengan baik

t R 2  to k2 '
 
t R1  to k1 '
 1 Komponen sukar dipisahkan

Untuk mengubahnya:
-diubah cairan fasa diam
-menurunkan suhu kolom
D. Resolusi

Tingkat pemisahan (derajat pemisahan) dua komponen

cuplikan oleh proses kromatografi

t R2  t R1 2(t R2  t R1 )
R 
1
( w1  w2 ) ( w1  w2 )
2

R= jarak antara 2 puncak dibagi dengan lebar puncak

pada alas

Arti nilai R
R ≥ 1,5 pemisahan hampir sempurna
R=1 tumpang suh besar
R<1 tumpang suh lebih besar
Resolusi 2 puncak dinyatakan dengan N,  dan k’

1    1  k2 ' 
R N  
4    1  k2 ' 

Dimana:
 t R2  t0 
k2 '   
 t0 

Cat: 1. Jika N, k’  0 atau   1 : resolusi buruk

2. Jika N, k’ > 1 atau diperbesar : resolusi baik
Cara lain memperbaiki resolusi:

1. Perbesar t artinya memperbesar selektivitas atau 

Cara: a. Perbesar L
b. Perbanyak jumlah fasa diam
c. Perbesar 
-turunkan suhu kolom
-memakai fasa diam yang lain
-memakai fasa gerak yang lain

2. Perkecil lebar puncak (w) artinya memperbesar efisiensi

kolom
cara: a. buat isian kolom lebih merata
b. Optimasikan kecepatan aliran gas pembawa
c. kurangi volum mati
d. kurangi diameter kolom
E. Kapasitas cuplikan

Banyaknya cuplikan yang dapat diadsorpsi pada fasa diam

tertentu sebelum terjadi muatan lebih (over loading):
mg cuplikan/gr fasa diam

Hubungan antara kapasitas sampel, resolusi dan kecepatan

analisis

resolusi

Kec. analisis Kapasitas sampel

Contoh Soal
 Senyawa X mempunyai waktu retensi 21,5 dengan
lebar alas puncak 4,1 cm. bila panjang kolom 250
nm. Berdasarkan puncak X, berapakah jumlah plat
teori dan Tinggi plat teori?
 Suatu sampel terdiri dari dua komponen, komponen
A dan B. kromatogram yang diperoleh memberikan
data sbb; tR (A) = 13 menit, tR(B) = 21,5 meni. T0
= 2 menit dan wb(A)= 2,1 cm da wb(B) = 4,1 cm.
Berapa resolusi antara kedua puncak dan faktor
pemisahan?
 Analisis kualitatif dan kuantitatif dengan Kromatografi

1. Analisis Kualitatif

•Dari data kromatogram dapat diperoleh informasi mengenai

besarnya waktu retensi (tR)
•Waktu retensi suatu senyawa adalah khas pada kondisi
percobaan yang sama (kec. Gas pembawa, pengaturan suhu
dan jenis kolom)

Cara:
a. Dibandingkan dengan standar
b. Dtambahkan zat standar
2. Analisis Kuantitatif

Dasarnya: luas permukaan puncak kromatogram (A) berbanding

lurus dengan jumlah/konsentrasi (Q) dari komponen
zat yang bersangkutan

Menentukan luas permukaan puncak

a. Gunting dan timbang puncak

b. Keliling puncak diukur dengan alat planimeter
c. Luas puncak ditentukan secara elektronis dengan alat
integrator elektronis
d. Apabila puncak berbentuk seperti kurva Gauss (simetri), maka
secara pendekatan dapat dituliskan

A = h x W1/2 h=tinggi puncak

Cara-cara menentukan konsentrasi

a. Metoda 100%
b. Metoda 100% yang diperbaiki/ normalisasi luas
c. Metoda luas permukaan spesifik
d. Metoda standar dalam/ internal standard
 a. Metoda 100%

-Dapat dilakukan jika puncak terpisah dengan baik

-Kepekaan detektor terhadap komponen dianggap sama

Q1 = A1/A x 100%

Q2 = A2/A x 100% A = luas ketiga komponen

Q3 = A3/A x 100%

b. Metoda 100% yang diperbaiki/ normalisasi luas

-Kepekaan detektor (f) terhadap komponen diperhitungkan

Q1 = f1 A1

Q2 = f2 A2 Qi = fi Ai f i Ai
%Qi  x100%
Q3 = f3 A3 f i Ai
 Cara menentukan fi

-Buat campuran standar dari komponen 1+2+3 yang murni

dimana Q1, Q2 dan Q3 diketahui.
-Dari campuran tersebut dibuat kromatogram pada kondisi
tertentu dan tetapkan harga masing-masing A
-Maka fi = Qi/Ai
-Fi digunakan untuk menentukan Q sampel.

C. Metoda luas permukaan spesifik

Luas permukaan spesifik (a) = A/Q

Menetapkan luas permukaan spesifik

1. Diinjeksikan cairan zat murni (massa jenis b) sebanyak

Volum V. Luas permukaan puncak X ditetapkan dari
kromatogram (A)

Maka
A
a
Vxb
2. Kemudian dibuat kromatogram dari cuplikan yang
mengandung jumlah X yang tidak diketahui dan
ditetapkan dan ditetapkan luas permukaannya, mis. Ax

Maka
Ax
Qx 
a
d. Metoda standar dalam/ internal standard

-Cara ini digunakan apabila yang akan ditetapkan adalah

salah satu atau beberapa komponen saja dari campuran
yang rumit.

Cara: Buat kromatogram dari cuplikan dengan kondisi

tertentu
-Misalkan yang akan ditetapkan, sampel no 4
-Maka tambahkan suatu zat lain (s), zat standar dalam, yang
tidak terdapat dalam cuplikan dengan konsentrasi yang
diketahui (Qs)
-dibuat lagi kromatogram dengan kondisi yang sama.
Maka akan berlaku : Q4= f4.A4 dan Qs = fs.As

Q4 f 4 A4 A4
  f
Qs f s As As

Cara menentukan f

-Dibuat kromatogram dari suatu campuran buatan yang

mengandung komponen 4 (standar) dan zat standar dalam yang
masing-masing konsentrasinya diketahui. Q4’ dan Qs’
-Ditentukan luas permukaannya, masing-masing A4’ dan As’
 Q4 '  f 4 A4 ' Qs '  f s As '

Q4 '  f 4 . A4 ' Q4 ' A4 '

atau  f
Qs '  f s . As ' Qs ' As '

Sehingga Q4 ' As '

f 
Qs ' A4 '

Qs A4
Maka konsentrasi sampel: Q4  f
As