Deteksi Salmonella sp pada feses anak penderita

Diare dengan metode kultur dan metode

Polymerase Chain Reactor (PCR)

Nama : Muthmainnah
NIM : P062181016
Kelas : PPS Biomedik/ Mikrobiologi

1
 BAB I
PENDAHULUAN

2
 A. Latar Belakang
Diare merupakan peningkatan volume tinja atau frekuensi buang air besar yang merupakan salah satu
tanda klinis dari penyakit gastrointestinal yang paling umum

Menurut WHO dan UNICEF, ada sekitar 2 miliar kasus penyakit diare di seluruh dunia setiap tahun dan
1,9 juta anak di bawah usia 5 tahun meninggal akibat diare setiap tahun, kebanyakan kasus tersebut
terjadi di negara berkembang

Infeksi virus, bakteri, dan parasit adalah penyebab paling umum diare

Salmonella adalah bakteri-jenis bacillus (berbentuk batang), bakteri gram negatif penghasil hidrogen
sulfida. Bakteri ini dapat menyebabkan infeksi usus yang sangat umum pada manusia dan hewan.

Penyakit diare masih memerlukan penanganan dan kajian dari berbagai aspek. Hasil pemeriksaan
laboratorium sangatlah penting sebagai penunjang dalam pemeriksaan diare bagi tenaga medis dalam
mendiagnosis

Salah satu teknik molekular yang digunakan untuk mendeteksi penyakit infeksi yang disebabkan oleh
Salmonella sp adalah teknik PCR.

3
 B. Rumusan masalah
Berdasarkan latar belakang di atas maka
rumusan masalahnya adalah:
1. Bagaimana hasil deteksi Salmonella sp dari
spesimen feses anak penderita diare dengan
metode kultur?
2. Bagaimana hasil deteksi Salmonella sp dari
spesimen feses anak penderita diare dengan
metode PCR?
3. Bagaimana perbandingan hasil dari metode
kultur dan PCR dalam mendeteksi Salmonella
sppada feses anak penderita diare?
4
 C. Tujuan Penelitian
1.Tujuan Mendeteksi bakteri Salmonella sp pada
Umum feses anak penderita diare dengan
metode kultur dan metode PCR
2. a. Untuk mengetahui hasil deteksi Salmonella sp dari
Tujuan spesimen feses anak penderita diare dengan metode
Khusus kultur.
b. Untuk mengetahui hasil deteksi Salmonella sp dari
spesimen feses anak penderita diare dengan metode
PCR.
c. Untuk mengetahui perbandingan hasil dari
metode kultur dan PCR dalam mendeteksi
Salmonella sp pada feses anak penderita diare.
5
 D. Manfaat Penelitian
1. Manfaat Teoritis
Diharapkan dari hasil penelitian ini dapat
menambah referensi terbaru dalam metode
diagnostik khususnya untuk mendeteksi dan
klasifikasi bakteri penyebab diare pada anak.
2. Manfaat Aplikatif
Diharapkan dari hasil penelitian ini dapat
memberikan informasi sebagai bahan
pertimbangan untuk digunakan dalam metode
diagnostik penegakan diagnosa penyebab diare
pada anak.
6
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Diare merupakan peningkatan volume tinja atau frekuensi buang air besar yang
merupakan salah satu tanda klinis dari penyakit gastrointestinal yang paling umum, tetapi
juga dapat mencerminkan gangguan primer di luar sistem pencernaan. Gangguan yang
mempengaruhi usus kecil atau usus besar yang dapat menyebabkan diare (Richard, 2018).
B. Salmonella adalah bakteri-jenis bacillus (berbentuk batang), bakteri gram negatif
penghasil hidrogen sulfida. Bakteri ini dapat menyebabkan infeksi usus yang sangat umum
pada manusia dan hewan (Lohmann, 2013). Bakteri Salmonella sp dapat tumbuh pada
berbagai macam media differensial dan selektif, media differensial berisi laktosa dengan
indikator pH tetapi tidak mengandung inhibitor non Salmonella, contoh media differensial
adalah EMB (Eosin Methylene Blue) dan MacConkey agar. Sedangkan media selektif adalah
media yang mengandung inhibitor Salmonella seperti SSA (Salmonella Shigella Agar), XLD
(Xylose Lisine Deoxycholate), dan Hektoen Enteric Agar. Pada media SSA koloni bakteri
Salmonella sp akan tampak berwarna putih berbintik hitam (Mahon, 2015).
C. Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan teknik in vitro yang digunakan untuk
melakukan replikasi atau amplifikasi bagian spesifik dari berjuta lipatan DNA hanya dalam
beberapa jam (Loeffelholz, 2006).

7
8
9
 F. HIPOTESIS
Terdapat bakteri Salmonella sp pada feses
anak penderita diare dengan metode kultur dan
metode PCR dimana metode PCR lebih cepat,
sensitif, dan efisien dibandingkan metode kultur.

10
 BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian
deskriptif dengan desain penelitian cross
sectional untuk mendeteksi bakteri
Salmonella sp pada feses anak penderita diare
dengan metode kultur dan metode PCR

11
 B. Lokasi dan Waktu Penelitian
1. Lokasi Penelitian:
a. Pengambilan spesimen rectal swab dilakukan di
beberapa Pusat Kesehatan Masyarakat di kota Makassar
yaitu Puskesmas Pampang, Barabaraya, Tamangapa, dan
Antang Perumnas.
b. Proses pengujian spesimen dilakukan di
Laboratorium Biologi Molekuler dan Immunologi Bagian
Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Hasanuddin
Makassar.
2. Waktu Penelitian:
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Mei - Agustus
2019.

12
 C. Populasi dan Sampel
1. Populasi
Populasi penelitian ini yaitu semua pasien
diare yang berkunjung ke puskesmas.
2. Sampel
Sampel penelitian ini yaitu semua anak
penderita diare yang berkunjung ke puskesmas
yang memenuhi syarat penelitian sesuai dengan
kriteria inklusi dan eksklusi.

13
 D. Variabel Penelitian
Variabel dependent dalam penelitian ini
adalah Salmonella sp.
Variabel independent dalam penelitian ini
adalah metode PCR dan metode kultur.

14
 E. Definisi Operasional
1. Diare adalah peningkatan volume tinja atau frekuensi buang air besar
yang merupakan salah satu tanda klinis dari penyakit gastrointestinal
yang paling umum, tetapi juga dapat mencerminkan gangguan primer di
luar sistem pencernaan.
2. Salmonella sp adalah bakteri gram negatif berbentuk batang, motil, famili
Enterobacteriaceae. Bakteri ini pertama kali dijelaskan pada tahun 1880
oleh Elberth dan dikultur pada tahun 1884 oleh Gaffky.
3. PCR adalah suatu metode enzimatis atau teknik biomolekuler untuk
melipatgandakan secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu
dengan cara in vitro dan dapat digunakan untuk memperkuat gen
spesifik sebelum pengklonan lebih lanjut dalam sel.
4. Kultur bakteri adalah metode isolasi bakteri yaitu proses mengambil
bakteri dari medium atau lingkungan asalnya dan menumbuhkannya di
medium buatan sehingga diperoleh biakan yang murni.

15
 F. Kriteria inklusi dan Eksklusi
1. Kriteria Inklusi: subjek penelitian ini adalah anak
SD yang berumur 6-12 tahun yang telah
mengalami buang air besar lebih dari 3 kali
dengan feses berair dan telah di diagnosis diare
oleh dokter, dan Orang tua/wali anak bersedia
berpartisipasi dalam penelitian.

2. Kriteria Eksklusi: Anak penderita diare dirawat

lebih dari 14 hari setelah kejadian diare, sudah
mengkonsumsi antibiotik atau tidak bersedia
ikut berpartisipasi dalam penelitian.

16
 G. Alat dan Bahan
1. Alat
Tabung reaksi, Erlenmeyer, gelas ukur,
cawan petri, batang ose, rak tabung, bunsen,
kapas steril, Mesin PCR (Biorad), Mesin
elektroforesis, Sentrifuge, Vortex, Waterbath,
Laminal Air Flow, BSC Tipe II, Mikropipet (1000
µl, 100 µl, 20 µl, 10 µl), Cetakan Agarosa, Tips
(1000 µl, 100 µl, 20 µl, 10 µl), Tabung
eppendorf, Tabung PCR, rak tabung eppendorf,
timbangan analitik, neraca analitik, kulkas,
freezer, perangkat UV.
17
2. Bahan
Spesimen rectal swab, Tip rectal swab, kertas
label, medium transport Cary-Blair dari penderita
diare. Media yang digunakan dalam penelitian ini
adalah Nutrient broth (NB), Medium McConkey
Agar, medium uji MR, medium uji VP, medium uji
indol, medium uji sitrat, Triple Sugar Iron (TSI) Agar,
medium uji fermentasi glukosa, enzim PCR, (Go taq
master mix green and hot star taq DNA
polymerase), RNAse free water, Agarose, Ethidium
bromide, TAE 0,5 Loading Dey, DNA Leader/ Marker,
PCR mix primer bfp: The oligonucleotide primers
S18 (5’- ACCGCTAACGCTCGCCTGTAT-3’) and S19 (5’-
AGAGGTGGACGGGTTGCTGCCGTT-3’).

18
 H. Prosedur Kerja
1. Teknik sampling
Sampel diperoleh melalui teknik rectal
swab dengan menggunakan tip swab steril ,
dimasukkan ke dalam medium transport Cary-
Blair dan segera dibawa ke laboratorium untuk
diuji.

19
2. Metode kultur
a. Sampel Rectal swab diinokulasikan ke medium
pemupuk yaitu BHIB
b. diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam.
c. Secara steril inokulum diambil sebanyak 1 mata
ose
d. Diinokulasikan ke medium SSA, medium selektif
untuk Salmonella sp, di inkubasi pada suhu 37°C
selama 24 jam.
e. Diamati koloni yang tumbuh Pada media SSA,
koloni bakteri Salmonella sp akan tampak
berwarna putih berbintik hitam
f. Dilanjutkan dengan uji biokimia

20
1) Uji sulfat, Indol, Motility
2) Uji urease
3) Uji Simmon Sitrat
4) Uji fermentasi karbohidrat
dan H2S
Diambil satu ose koloni Salmonella sp dari medium
SSA, diinokulasikan ke medium SIM dengan cara
ditusuk , diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C.
Diambil satu ose koloni Salmonella sp dari medium
SSA, diinokulasikan dalam kaldu urease dan
diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C.
Diambil satu ose koloni Salmonella sp dari medium
SSA , diinokulasikan dengan cara ditusuk lalu digores
pada medium Simmon sitrat, diinkubasi selama 24
jam pada suhu 37°C
Diambil satu ose koloni Salmonella sp dari medium
SSA lalu diinokulasikan dengan cara ditusuk lalu
digores pada medium TSIA dan diinkubasi selama 24
jam pada suhu 37°C.
21
5) Uji MR Diambil satu ose koloni Salmonella sp dari
medium SSA lalu diinokulasikan ke dalam
kaldu MR dan diinkubasi selama 24 jam
pada suhu 37°C. Uji MR dilakukan dengan
meneteskan 10 tetes indikator merah
metal ke dalam kaldu.
6) Uji VP Diambil satu ose koloni Salmonella sp
dari medium SSA lalu diinokulasikan ke
dalam kaldu VP dan di inkubasi selama 24
jam pada suhu 37°C. Uji VP dilakukan
dengan meneteskan 10 tetes α-naftol dan
10 tetes larutan KOH 40% ke dalam kaldu,
kocok dan lihat perubahan warna.

22
 3.Metode PCR
a) Ekstraksi DNA
Proses ekstraksi sampel DNA dilakukan sesuai
dengan protokol/handbook yang dikeluarkan oleh
Qiagen untuk penggunaan QIAamp® DNA Blood
Mini Kit dalam mengisolasi/mengekstraksi DNA
mikroba.
b)Amplifikasi PCR
c) Elektroforesis pada Gel Agarose
d) Running elektroforesis
e) Gel Dok

23
 I. Penyajian Data
Data hasil uji berupa terdeteksi (positif)
atau tidak terdeteksi (negatif) bakteri Salmonella
sp pada feses anak penderita diare dengan
metode kultur dan PCR.

24
25
Terima Kasih

26