P E N G U J I A N O B AT

SECARA IN VITRO
A M I R A FA D H I L A
1611013041
 PENGERTIAN
Pengujian farmakologi secara in vitro berarti penelitian menggunakan komponen organisme yang
dilakukan diluar sistem fisiologi
Contoh : Komponensel, DNA/RNA
Uji in vitro merupakan suatu metode uji pada media buatan yang sesuai dengan lingkungan optimal
yang diperlukan oleh mikroba untuk tumbuh dan berkembang biak.
Uji tersebut dilakukan untuk melihat daya kerja antimikrobial suatu ekstrak. Metode yang dapat
digunakan pada pengujian in vitro misalnya adalah metode difusi atau metode cakram kertas
antibiogram Kirby- Bauer dan menggunakan metode dilusi.
Pada metode difusi parameter yang diamati adalah zona hambat yang terbentuk, yaitu dengan
mengukur diameter zona jernih di sekitar sumur dengan penggaris.
 METODE
1. Ekstrak etanol daun kamboja diencerkan menjadi konsentrasi 1%, 5%, 10% dan 20% dengan cara
dicampur aquabidest. Kemudian, pada bagian bawah cawan petri dibuat garis menjadi tujuh bagian,
yaitu K+, K-, K, 1%, 5%, 10%, dan 20%.
2. Kontrol negatif digunakan DMSO 30% dan kontrol positif digunakan tetrasiklin 30µg/ml.
3. Media nutrient agar dan TSA pada plate (petri dish) dipanaskan menggunakan microwave hingga
mencair lalu dimasukkan ke dalam waterbath pada 0 suhu 50 C.
4. Aeromonas 5 hydr ophila konsentrasi 10 cfu sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam petri dish dan
diratakan, lalu nutrient agar atau TSA dituang di atasnya.
5. Petri dish dibiarkan agak terbuka dalam laminar air flow selama 5-10 menit sampai media agar
mengeras.
6. Kertas cakram dicelupkan ke dalam ekstrak etanol daun kamboja kosentrasi 1%, 5%, 10% dan 20% ,
kemudian diletakkan di media sesuai dengan pembagian garis. Begitu pula dengan K+ maupun K-
tetap diberi kertas cakram.
7. Lalu inkubasikan pada suhu 37C selama 24 jam.
8. Semua pekerjaan ini dilakukan di laminar air flow dan api bunsen untuk menjaga agar tetap steril dan
menghindari kontaminasi.
• Tahap pengujian in vitro lainnya adalah dengan menggunakan metode dilusi, yaitu
dengan mencampurkan bakteri, media dan ekstrak etanol daun kamboja sehingga
dapat diamati ada atau tidaknya bakteri yang tumbuh.
• Pertama-tama, media nutrient agar atau TSA dipanaskan sampai mencair, dituang
ke dalam tabung dan selanjutnya ekstrak etanol daun kamboja dimasukkan ke
dalam tabung tersebut dan diratakan. Setiap konsentrasi ekstrak diberikan
perlakuan yang sama seperti tahap tersebut di atas. Kemudian, isolate Aeromonas
hidrophila digoreskan dengan metode zig-zag pada media agar miring.
• Tahap kerja yang sama juga dilakukan di media yang berbeda, yaitu digunakan petri
dish. Bakteri yang digoreskan dengan metode T kemudian inkubasikan pada suhu
37C selama 24 jam.
• Pengujian antibakteri dilakukan dengan memasukkan sebanyak 50 µl ekstrak sirih
(menggunakan mikropipet) pada setiap sumur yang telah dibuat pada media Nutrient Agar.
• Media yang digunakan yaitu Nutrient Broth (NB) dan Nutrient Agar (NA). Sebagai media
peremajaan bakteri digunaan media NA miring dalam tabung reaksi.
• Biakan bakteri diinokulasikan secara aseptik dalam tabung reaksi yang berisi NA miring steril
masing-masing berjumlah tiga biakan murni, diinkubasikan pada suhu kamar selama 24 jam,
diinokulasikan lagi ke NB, dan selanjutnya diinkubasikan selama 24 jam.
Teknik pengujian dikembangkan dari metode Kirby-Bauer. Metode yang digunakan pada pengujian
aktivitas ialah metode difusi agar dengan cara sumur. Prosedur pengujian sebagai berikut :
1. Disiapkan media yaitu NA solid dan semi solid, masing-masing sebanyak 200 ml.
2. NA dibuat dengan cara: ke dalam erlenmeyer yang berisi 200 mL akuades dimasukkan peptone
1.0 gr, yeast exctract 0.6 gr , NaCl 1.0 gr dan agar 3.0 gr untuk NA solid, dan 1.5 gr untuk NA
semi solid. Setelah itu direbus hingga berwarna kuning bening atau larutan telah homogen,
disterilkan pada suhu 1210C dan tekanan 15 psi, dan selanjutnya didinginkan sampai suhu ± 40-
50C.
3. Secara aseptik NA solid dituangkan sebanyak 15–20 mL ke dalam cawan petri lalu dibiarkan
sampai mengeras. NA solid yang telah dituang pada cawan petri steril dijadikan lapisan bawah.
4. Setelah mengeras, secara aseptik dituangkan sebanyak 10 mL NA semi solid yang telah
dicampurkan bakteri uji sebagai lapisan pembenihan. Secara hati-hati dibuat sumur agar media sebagai
lapisan pembenihan tidak rusak.
5. Setelah terbentuk sumur, maka dimasukkan ekstrak kasar bahan uji sebanyak 50 µl. Konsentrasi
ekstrak yang diujicobakan yaitu 0%, 25%, 50%, 75% dan 100%. Selanjutnya diinkubasikan pada suhu
37oC selama 24 jam.
6. Setelah itu, diamati dan diukur diameter zona hambat yang terbentuk yaitu daerah jernih di
sekeliling sumur. Data yang diperoleh akan dibuat persamaan linear sederhana, sehingga diperoleh
persamaan linear dari antibiotik untuk setiap jenis bakteri.
 Pengukuran aktivitas anti-mikroba
berdasarkan pengamatan diameter zona hambat
Aktivitas ekstrak sirih diukur dari luas zona bening yang terbentuk di sekitar sumur larutan uji
dan dibandingkan dengan luas antibiotik pembanding. Pengujian ini dilakukan sebanyak tiga kali
ulangan. Aktivitas antibakteri ekstrak uji dihitung berdasarkan persamaan yaitu:
THANKYOU