“Western Blotting & ELISA”

Kelompok 3 Biologi Sel & Molekul:

Vani Vrenika 18.72.019248
Markadita Angela 18.72.019235
Dhinda Shellya 18.72.019270
Elvina Juniarti 18.72.019246
Puja Oppy R.S.W 18.72.019237
Imi Cankraw 18.72.019256

Dosen Pengampu : Silvani Permatasari.,M.Biomed

 Alat Dan Bahan
WESTERN
BLOTTING Prinsip

Tahapan Western
Blotting

Prosedur Kerja

Contoh kasus/penyakit
yang di identifikasi
 Pengertian Western Blotting
Western Blotting adalah istilah yang dipakai untuk
proses transfer dan imunodeteksi protein pada gel yang
bertujuan untuk : (1) mengetahui keberadaan dan berat
molekul protein sampel dalam suatu campuran, (2)
membandingkan reaksi silang antar protein, (3)
mempelajari modifikasi protein selama sintesis. Dengan
cara ini, protein dalam hitungan nanogram dapat
terdeteksi. (Fatchiyah, dkk 2011).
 Pengertian Western Blotting
Western Blotting (WB) merupakan suatu teknik untuk menandai suatu
protein pada membran nitroselulosa, nilon, atau membran transfer lain
setelah protein tersebut terpisahkan melalui elektroforesis. Protein
tersebut kemudian dapat dideteksi melalui metode autoradiografi,
pelabelan dengan senyawa-senyawa fluoresen, pelabelan dengan 125I,
pelabelan dengan antibodi terikat protein, lektin atau gen pengikat
spesifik lainnya. Western blot digunakan secara luas untuk menentukan
ukuran antigen dan antibodi yang diketahui, serta untuk diidentifikasi.
Teknik ini memiliki beberapa keuntungan seperti :
1. Teknik ini mampu mendeteksi protein dengan sensitivitas tinggi
karena protein dipekatkan dalam volume kecil.
2. Waktu yang dibutuhkan efisien.
3. Reagens yang digunakan lebih ekonomis. (Attwood et al., 2006)
 Bahan
Education
Plan Bahan mikrobiologi : Saccharomyces cerevisiae, S6 killer sensitive strain, wild

type. Bahan-bahan kimia pro-analisa (p.a) yang biasa digunakan dalam penelitian

rekayasa genetic seperti media YEPD (1%yeast extract, 2%bacto peptone dan 2%

D-glukosa), Tris-HCl pH7.4, PMSF (Fenilmetilsulfonil fluoride), ReagenLowry, Folin-

ciocalteu 1N, Tris-Cl pH 8.8 dan 6.8, SDS 10%, APS 10%, TEMED(N,N,N’,N’,-

tetrametiletilen diamin), akrilamiddan bis-akrilamid, Coomassie Blue 0,1% untuk

staining protein, Western blot Enhanced Chemiluminescence (ECL)

RPN2108(Amersham pharmacia biotech).

 Alat
Education
 Peralatan gelas dan bukan gelas yang meliputi erlenmeyer, backer glass, tabung eppendorf 1.5 mL
Plan
pipet mikro 0,5-2,5 L, 0,5-10 L, 10-100 L, untuk pengambilan larutan dalam skala mikro.
 Autoclave (H7101 China) untuk sterilisasi peralatan gelas dan bahan tahan panas.
 Millipore (Miller-GP, 0,22 M) untuk sterilisasi bahan cair tidak tahan panas.
 Laminarflow ( Labonco Co, USA), Spektrofotometer UV-Vis (Hitachi, Model 100-60) untuk
penetapan OD dan analisa kuntitatif protein.
 Sentrifuge (Beckman J2-HS dan Jouan MR1822), Microsentrifuge (Biofuge Fresco Heraus,
Germany) untuk pemisahan sel dari suspense dan pengendapan sel.
 Vortex (Fisher Vortex Genie) untuk pemecahan sel.
 Mini-Protean IISlab Cell Electrophoresis (Bio Rad), Inkubator (Thermolyine ROSI 1000), Shaker
Incubator (Dubnoff GCA) untuk menginkubasi biakan dalam media padat dan cair.
 Freezer model 8571 (forma Scinetific Inc., USA) untuk penyimpan kultur pada suhu -70°C. Trans-
blotsemi dryWestern blot seri 221 BR17045 (Bio Rad).
 Prinsip Kerja Western Blotting
Education
Plan
 Tahapan Western Blotting
Education
Plan 1.Tahap Pertama
 Tahapan Western Blotting
Education 2.Tahap Kedua
Plan
 Tahapan Western Blotting
Education 3. Tahap Ketiga
Plan
Tahap ketiga merupakan deteksi protein yang telah dipindahkan ke membran transfer.
Deteksi protein tersebut memanfaatkan interaksi antara antigen dan antibodi yang
bersifat spesifik. Variasi metode-metode tersebut terutama terletak pada penggunaan
antibodi primer dan sekunder, serta penggunaan molekul penanda. Berdasarkan
penggunaan antibodi primer dan antibodi sekunder, ada dua metode deteksi, yaitu:
metode langsung dan metode tidak langsung. Metode langsung menggunakan
antibodi primer yang telah terkonjugasi dengan molekul marker. Metode tidak
langsung menggunakan antibodi primer dan antibodi sekunder. Antibodi primer
berfunsi mengikat protein target, sedangkan antibodi sekunder berfungsi mengikat
antibodi primer dan terkonjugasi dengan molekul penanda. Molekul penanda yang
digunakan juga bervariasi. Molekul penanda yang umum digunakan diantaranya
adalah enzim alkalin fosfatase (AP), enzim horsedish peroksidase (HRP), immunogold,
dan 125I. Masing-masing molekul penanda tersebut memiliki kelebihan dan
kekurangan. Molekul penanda immunogold memiliki sensitifitas paling tinggi, yaitu
immunogold (1-25 pg). HRP, AP dan 125I memiliki sensitivitas relatif rendah yaitu 10-20
pg, 10-50 pg, dan 50-100 pg (Bollag et al., 1996).
 Prosedur Kerja
Education
Plan
1. Menyiapkan sampel yang akan diteliti, apakah
itu limfosit T atau fibroblas ataupun sel darah
tepi. Sampel harus dijaga tetap dingin.
2. Menyiapkan buffer agar pH dapat berada pada
jangkauan yang stabil.
3. Menyiapkan antibodi yang akan digunakan
sebagai pelacak.
4. Melisis sel untuk mengeluarkan protein yang
diinginkan dari sel.
 5. Memisahkan protein berdasarkan ukurannya
Education dengan adanya arus listrik menggunakan gel
Plan elektroforesis.
6. Mentransfer protein dengan menggunakan
teknik elektroblotting. Teknik ini menggunakan
arus listrik untuk menarik protein dari gel ke
membran.
7. Deteksi dilakukan dengan antibodi yang telah
dimodifikasi bersama dengan sebuah enzim
yang disebut reporter enzyme.
8. Analisis.
 Manfaat Western Blotting
Education
Manfaat secara umum dari analisis westrern blot antara lain:
Plan
1. Untuk mengidentifikasi dan memposisikan protein berdasarkan kemampuannya

untuk berikatan dengan antibodi yang spesifik.

2. Dapat memberikan informasi tentang ukuran dari protein.

Berdasarkan penguraian aplikasi teknik western blot , salah satu manfaat yang telah
diperoleh dari analisis western blot ini yaitu konstruksi antibodi anti eRF3 telah
dilakukan meskipun antibodi belum terkarakterisasi dengan baik. Sehingga
dilakukanlah analisis western blot dengan cara mengukur tingkat spesifitas dan
sensitifitas antibodi anti eRF3 terhadap protein eRF3. Spesifitas antibodi ditentukan
berdasarkan kemampuan antibodi ini dalam mengenali epitop protein eRF3 dari
berbagai protein yang terdapat pada crude extract ragi, sedangkan sensitifitasnya
ditentukan melalui variasi jumlah antigen (eRF3) yang berinteraksi dengan antibodi
tersebut.
 Keuntungan Teknik Blotting
Education 1. Akses yang lebih besar kepada molekul yang telah terikat ke permukaan
Plan
lembaran dibandingkan kepada molekul yang masih berada di dalam gel
atau matriks.
2. Lebih sedikit reagen yang dibutuhkan.
3. Waktu untuk melakukan staining dna destaining, inkubasi, mencuci, dll
dapat lebih singkat.

4. Pola yang terbentuk dapat dikeringkan dan disimpan berbulan-bulan

sebelum dianalisis.
5. Dapat dibuat banyak replika pola tersebut untuk memungkinkan banyak
metode analisis yang dipakai.
 1

ELISA 3
2

Fungsi dari
Alat & Bahan
Alat & Bahan

4 Prosedur Kerja

Kasus/penyakit
yang di identifikasi
 Pengertian ELISA
(Enzim-linked immunosorbent assay)
Enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) atau dalam Bahasa indonesianya
disebut sebagai uji penentuan kadar imunosorben taut-enzim, merupakan
teknik pengujian serologi yang didasarkan pada prinsip interaksi antara
antibodi dan antigen. Pada awalnya, teknik ELISA hanya digunakan dalam
bidang imunologi untuk mendeteksi keberadaan antigen maupun antibodi
dalam suatu sampel seperti dalam pendeteksian antibodi IgM, IgG, & IgA
pada saat terjadi infeksi (pada tubuh manusia khususnya). Namun seiring
dengan perkembangan ilmu pengetahuan, teknik ELISA juga diaplikasikan
dalam bentuk lain termasuk menganalisis kadar hormon yang terdapat dalam
suatu organisme.
 Fungsi ELISA
Secara singkat dapat dikatakan bahwa teknologi ELISA yang digunakan untuk
asai hormon dalam cairan tubuh adalah system competitive enzyme
immunoassay yang analog dengan teknik RIA. Antigen yang berlabel dan
antigen yang tidak berlabel saling bersaing untuk berikatan
dengan tapak pengikatan antibody yang terdapat dalam jumlah terbatas.
Saturasi antibodi terjadi secara simultan bila semua reaktan diinkubasikan
bersama-sama. Contoh reaksi seperti ini adalahELISA untuk mengukur
progesteron, estradiol, dan kortisol. Pengukuran hormonkortisol dalam saliva
menggunakan teknik ELISA dapat mengetahui tingkat stresyang di alami oleh
organisme (Haussmann et al., 2007).
 Keuntungan ELISA
ELISA (Enzim-linked immunosorbent assay) atau penetapan kadar imunosorben taut-
enzim merupakan uji serologi yang umum digunakan
diberbagai laboratorium imunologi. Uji ini memiliki beberapa keunggulan seperti teknik
pengerjaan yang relatif sederhana, ekonomis dan memiliki sensitivitas yang cukup tinggi.
Pemeriksaan ELISA dapat digunakan untuk mendeteksi antibodi dalam tubuh manusia
maupun hewan. Terdapat berbagai teknik dalam pemeriksaan ELISA. Tes ini dapat
dilakukan dengan kit yang sudah jadi atau dapat juga dilakukan dengan menggunakan
antigen yang diracik sendiri (Setiawan, 2007). ELISA tradisional secara khusus memiliki
reporter dan substrat yang menghasilkan beberapa bentuk perubahan warna yang dapat
diamati untuk mengetahui kehadiran antigen atau analyte. Bentuk teknik ELISA terbaru
seperti teknik flurogenic, electro chemiluminescent, dan real-time PCR dibuat untuk
mengetahui sinyal kuantitatif. Metode ini dapat memberikan berbagai keuntungan
diantaranya sensitifitas yang tinggi dan bersifat multiplexing (Leng et al, 2008).
 Alat dan Bahan
Alat
Mesin Sentrifuge dan Microsentrifuge
Tabung sampel darah (BD Vacutainer® Blood Collection
Tubes dengan K2 EDTA 3,6 mg)
ELISA Washer
ELISA Reader Multiskan GO
Perlengkapan untuk Pengambilan sampel darah
(Tourniqued, Swab Alkohol, Spuit 3cc)
Tabung Microsentrifuge
Aquades
Bahan
Darah Sampel
ELISA KIT MyBioSource untuk Pemeriksaan Human
PREALBUMIN yang terdiri dari :
a) Diluent Consentrate 5x
b) Wash Solution 20x
c) Enzyme Antibody Conjugate 100x
d) Chromogen-Substrate Solution
e) Stop Solution
f) Anti-Human Prealbumin ELISA Microplate
g) Human Prealbumin Standard (Human Prealbumin
Calibrator)
Micropipet single channel ukuran 100-1000 µl dan 20-
200 µl serta micropipette multichannel
Tip mikropipette
Vortex
Gelas ukur
Aluminium Foil
 Fungsi Alat

1.Elisa reader berfungsi untuk membaca plate elisa untuk

menentukan konsentrasi antigen atau antibody yang
terkandung dalam sampel.
2.Elisa washer adalah alat yang digunakan untuk
membersihkan plate pada saat pengerjaan metode elisa.
Prosedur Kerja ELISA
A. Sampel
1. Pengambilan sampel darah masing-masing
tabung 1,5 cc sampel 1 dan 2 dimasukkan ke
dalam tabung yang berisi EDTA untuk diambil
plasma darahnya, sementara sampel ke 3
dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuge
tanpa EDTA untuk diambil serumnya.
Selanjutkan dilakukan sentrifugasi ketiga sampel
darah tersebut untuk memisahkan plasma darah
dan serum darah dengan sel darah.

Tabung sampel+EDTA 1 dan 2 → sentrifugasi

dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit.

Tabung mikrosentrifuge 3 → dengan

mikrosentrifuge kecepatan 3000 rpm selama 10
menit.
2. Pengenceran Diluent Solution 5X → 1X
Untuk mendapatkan 10 ml diluent sol 1x= 2 ml
Diluent sol. + 8 ml Aquades.

3. Pengenceran sampel
Siapkan 2 tabung eppendorf untuk tiap
sampel :
 Tabung I = 5 µl Sampel + 495 µl Diluent 1X
1/100 dilution → sentrifugasi.
 Tabung II = 5µl Tabung I + 495 µl Diluent 1X
1/10000 dilution → sentrifugasi.
B. Standar
Siapkan 8 tabung eppendorf :
•Standard 7 = 8 µL Human Pre-Calibrator + 677 µL
Diluent 1X → sentrifugasi.
•Standard 6 = 300 µL standard 7 + 300 µL Diluent 1X
→ sentrifugasi.
•Standard 5 = 300 µL standard 6 + 300 µL Diluent 1X
→ sentrifugasi.
•Standard 4 = 300 µL standard 5 + 300 µL Diluent 1X
→ sentrifugasi.
•Standard 3 = 300 µL standard 6 + 300 µL Diluent 1X
→ sentrifugasi.
•Standard 2 = 300 µL standard 3 + 300 µL Diluent 1X
→ sentrifugasi.
•Standard 1 = 300 µL standard 2 + 300 µL Diluent 1X
→ sentrifugasi.
•Standard 0 = 600 µL Diluent 1X.
Well ELISA (Anti-Human Prealbumin ELISA Microplate)

1. Dengan menggunakan micropipet,

masukkan Standard 7-0 ke dalam well
kolom 1 (A-H) sebanyak 100 µL.
2. Dengan menggunakan micropipet,
masukkan Sampel 1-3 ke dalam well
kolom 2 (A-H) sebanyak 100 µL.
3. Diinkubasikan pada suhu ruangan selama
60 ± 2 menit. Tutup well plate dengan
plastik transparan dan dalam posisi
sejajar.
 4. Siapkan Wash Solution 20X → 1X sebanyak
100 ml. = 5 ml Wash Solution + 95 ml
Aquades.
5. Setelah selesai diinkubasi, well plate dicuci
b.
dengan larutan Wash Solution sebanyak 4
kali dengan menggunakan alat Elisa
Washer(Thermo Scientific™ Wellwash™
Microplate Washer).
c
6. Masukkan 100 µL TMB Substrate Solution
(Chromogen-Substrate Solution) pada
masing-masing well dan inkubasi dengan
suhu ruangan dan keadaan gelap selama 10
menit.
7. Kemudian masukkan 100 µL
Stop Solution pada masing-
masing well.
8. Masukkan seluruh well ke
Elisa Reader Multiskan GO
dan lakukan pembacaan
hasil dengan gelombang
absorbansi 450 nm.
Kasus/Penyakit yang di identifikasi
Pada uji western blot dan ELISA ini adalah untuk uji virus HIV. HIV adalah singkatan
dari human immunodefisiency virus, yaitu virus yang menyerang sistem kekebalan
tubuh manusia sehingga membuat tubuh rentan terhadap berbagai penyakit.
Acquired immune deficisncy syndrome (AIDS) adalah suatu penyakit retrovirus yang
disebabkan oleh HIV dan ditandai dengan immunosupresi berat yang menimbulkan
infeksi oportunitik. Neoplasma sekunder dan munifestasi neurologis, HIV telah
ditetapkan sebagai agens penyebab AIDS. AIDS adalah suatu kumpulan kondisi klinis
tertentu yang merupakan hasil akhir dari infeksi virus HIV. Defenisi AIDS yang telah
ditetapkan oleh pusat pengendalian penyakit, telah berubah beberapa waktu sejak
gejala pertama ditemukan pada tahun 1981. Secara umum defenisi ini menyusun
suatu titik dalam kontinum penyimpangan HIV dimana penjamu telah menunjukkan
secara klinis disfungsi imun. Jumlah besar infeksi oportunistik dan neoplasma
merupakan tanda supresi imun berat sejak tahun 1993. Definisi AIDS telah meliputi
jumlah CD4 kurang dari 200 sebagai criteria ambang batas. Sel CD4 adalah bagian
dari limposit dan satu target sel dari infeksi HIV.
 KESIMPULAN
Test ELISA atau Western Blot yang pada umumnya
dipakai untuk mendiagnosa infeksi HIV hanya bisa
mendeteksi interaksi antara protein dan antibodi
yang diperkirakan berhubungan dengan HIV.
Keduanya tidak bisa mendeteksi HIV itu sendiri.
Dan bertentangan dengan pandangan umum, test
“viral load” yang lebih baru tidak bisa mengukur
tingkat aktual virus dalam darah.
Referensi Atwood, T.K., P.N. Campbell, J.H. Parish, A.D. Smith, J.L. Stirling
dan F. Vella (Ed). 2006. Oxford Dictionary of
Biochemistry and Molecular Biology, Revised Edition.
Oxford. University Press.

Bollag, D.M., M.D. Rozycki, S.J. Edelstein. 1996. Protein Method.

Wiley-Liss. Inc.

Hausmann S, et al. (2007) Biochemical and genetic analysis of

RNA cap guanine-N2 methyltransferases from Giardia
lamblia and Schizosaccharomyces pombe. Nucleic
Acids Res 35(5):1411-20.

Fatchiyah, dkk. 2011. Biologi Molekular. Jakarta. Erlangga.

Thank You