METODE BCA

(Bicinchoninic Acid)

Kelompok 4
Kelas : 4D - Farmasi
1. Dian Arisnawati (31116160)
2. Gema Nurahman (31116166)
3. Farha Lestari (31116164)
4. Ridha Ishmania S.S (31116184)
5. Sri Zulfah Zakiah D. (31116193)
6. Sari Rachmawati (31116188)
 Keuntungan Pembahasan
Pengertian Fungsi dan
dan Jurnal
Prinsip
Kerugian
 PENGERTIAN METODE BCA

STRUKTUR BICINCHONINIC ACID (BCA)

Metode BCA merupakan kombinasi reduksi terkenal dari Cu2+ Ke Cu1+ oleh protein dalam medium
alkali dengan sensitifitas yang tinggi dan selektif deteksi warna yang tinggi dari kation tembaga
(Cu1+) oleh BCA. Langkah awal dimana khelat tembaga protein dalam alkali membentuk warna
biru kompleks (rx biuret). Dikenal sebagai rx Biuret ini karena bentuk kompleksnya serupa dengan
biuret senyawa organik ( NH2-CO-NH-CONH2) dan ion tembaga.
KEUNTUNGAN DAN KERUGIAN METODE BCA

Keuntungan utama dari Kerugiannya yaitu zat

metode BCA adalah yang mereduksi tembaga
bahwa sebagian besar akan menghasilkan
surfaktan (bahkan jika warna pada alat uji BCA,
ada dalam sampel pada sehingga mengganggu
konsentrasi hingga 5%) ketepatan kuantitas
kompatibel, sederhana, protein.
sensitivitas tinggi, dan
stabil.
FUNGSI METODE BCA

Fungsi dari metode BCA ini

yaitu untuk kuantitasi total
protein dalam sampel.
PRINSIP METODE BCA

Prinsip dari metode BCA ini adalah

bahwa protein dapat mereduksi Cu2+
menjadi Cu1+ dalam larutan alkali
(reaksi biuret) dan menghasilkan
pembentukan warna ungu oleh asam
bicinchoninic.
 JURNAL
Protein Measurement Using Bicinchoninic Acid: Elimination of Interfering Substances
 PENDAHULUAN

BAHAN DAN
KESIMPULAN
METODE

PEMBAHASAN HASIL
 PENDAHULUAN

Kuantisasi protein berdasarkan bicinchoninic acid (BCA) sederhana, sensitif, dan toleran
terhadap banyak deterjen dan zat yang diketahui mengganggu metode Lowry. Namun,
senyawa tertentu yang sering digunakan selama pemurnian protein mengganggu tes
protein BCA. Zat-zat tertentu (mis., Glukosa, merkaptoethanol, dan dithiothreitol)
menimbulkan absorbansi yang kuat pada 562 nm ketika dikombinasikan dengan reagen
kerja BCA. Absorbansi tampaknya identik dengan respons normal yang ditimbulkan oleh
protein. Agen lain (mis., Amonium sulfat dan amfolitik tertentu) mengurangi perkembangan
warna yang diinduksi protein dan menggeser panjang gelombang dari respons warna.
Kedua jenis gangguan dapat dihilangkan dengan protein pemicu selektif dengan
deoxycholate dan asam trikloroasetat sebelum bereaksi dengan asam bicinchoninic.
Jurnal ini membahas tentang cara penghilangan cepat dan efisien pada banyak zat yang
mengganggu yang biasanya digunakan selama pemurnian protein.
 BAHAN

BSA (A-7030) Reagen BCA

Glukosa CuSO4.5H2O

2-D Pharmalyte (pH 3-lo) Air deionisasi

Polybuffer (pH 6-9) DOC (Sodium deoxycholate)

Dithiothreitol (DTT) TCA (Trichloroacetic acid)

Mercaptoethanol Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)

Servalyt (pH 7-9) NaOH 0,1N

 METODE

STANDAR ASSAY

Siapkan reagen BCA

Diinkubasi pada suhu
Sampel (0,1 ml) campurkan 50 Vol
37° c selama 30 menit
dicampurkan dengan larutan BCA dengan 1
kemudian dibaca
reagen BCA (2,0 ml) Vol 4% CuSO4.5H2O
pada 562 nm.
sebelum diuji.
 METODE
PRECIPITATION ASSAY
Pengujian dilakukan dalam tabung microcentrifuge (ukuran 1,5 ml).

Setelah penambahan protein, volume akhir disesuaikan menjadi 1,0 ml dengan air deionisasi
dan 0,1 ml natrium deoksikolat (DOC) (0,15%, b/v) yang telah ditambahkan.

Setelah didiamkan pada suhu kamar selama 10 menit, tambahkan 0,1 ml asam trikloroasetat
(TCA) (72%, b/v).

Sampel di vorteks dan disentrifugasi pada 3000 rpm selama 15 menit pada suhu kamar.

Supernatan diambil dan endapan dilarutkan dengan 0,05 ml natrium dodesil sulfat (SDS) (5%,
b/v) yang mengandung 0,1 N NaOH. Segera ditambahkan reagen BCA (1 mL), setiap sampel
di vortex dan diinkubasi pada suhu 37° c selama 30 menit. Optical density diukur pada
Panjang gelombang 562 nm menggunakan spektrofotometer.
HASIL DAN PEMBAHASAN
KESIMPULAN
Secara umum, metode BCA lebih unggul daripada metode Lowry
untuk penentuan protein karena sederhana, sensitif, dan toleran
terhadap banyak deterjen dan buffer. Modifikasi dalam standar
protokol BCA yang diterapkan pada jurnal ini memungkinkan
penghapusan zat yang mengganggu dengan cepat dan efisien
(misalnya ; dithiothreitol, mercaptoethanol, ampholytes, ammonium
sulfate, dan glukosa) yang biasanya digunakan selama pemurnian
protein.
TERIMAKASIH
BERITA ACARA
 BERITA ACARA
1. Bagaimana reaksi pembentukan BCA? Bagaimana reagen mendeteksi protein
sampai terjadi perubahan warna dan di spektrofotometri apa yang dilihat?
JAWAB:
Prinsip metode BCA adalah adanya protein
mampu mereduksi ion kupri menjadi ion
kupro dibawah kondisi basa. Ion kupro
membentuk kompleks dengan reagen BCA
(yang berwarna hijau apel) membentuk
warna keunguan. Warna ungu yang
terbentuk sebanding dengan konsentrasi
protein.
Reaksi metode BCA terjadi dalam 2 tahap:
1) Reduksi Cu2+ oleh ikatan peptida dari
protein menghasilkan Cu+. Jumlah Cu2+ yg
direduksi setara dengan jumlah protein pada
bahan.
2) Pengkelatan Cu+ oleh 2 molekul
bicinchoninic acid (BCA) sehingga dihasilkan
warna ungu yang nantinya dilihat di
spektrofotometri pada panjang gelombang
REAKSI PEMBENTUKAN BCA 562 nm
 BERITA ACARA
2. BCA berbasis Nitrogen atau Karbon? Hubungkan dengan agen pengganggunya.
JAWAB:

STRUKTUR BCA STRUKTUR GLUKOSA

BCA berbasis Karbon (C) , karena bila dilihat dari agen penganggu salah satunya seperti
glukosa. Pada struktur glukosa banyak mengandung atom karbon (C) dan OH, tidak
mengandung atom nitrogen sehingga BCA berbasis karbon karena mengandung banyak
atom C kemudian atom C yang terdapat pada struktur glukosa/BCA akan berikatan dengan
Cu yang terdapat pada larutan tembaga yang basa direduksi oleh karbohidrat yang memiliki
gugus aldehida atau keton bebas sehingga akan membentuk kupro oksida (Cu2O) yang
menghasilkan warna kuning sampai merah.
 BERITA ACARA
3. Kenapa glukosa harus dihilangkan atau di endapkan? Bagaimana reaksi glukosa
dengan protein sehingga merupakan agen pengganggu?
JAWAB:

REAKSI ANTARA GLUKOSA DENGAN Cu

Glukosa harus diendapkan karena dilihat dari prinsip metode BCA yaitu reduksi Cu2+
menjadi Cu+ yang dapat menghasilkan warna ungu oleh asam bicinchoninic. Ketika
terdapat zat pengganggu yaitu glukosa maka Cu tidak hanya akan bereaksi dengan protein
tetapi akan bereaksi juga dengan glukosa dimana apabila larutan-larutan tembaga yang
basa direduksi oleh karbohidrat yang memiliki gugus aldehida atau keton bebas akan
membentuk kupro oksida (Cu2O) yang menghasilkan warna kuning sampai merah.
Sehingga data yang didapat tidak valid.
 BERITA ACARA
4. Fungsi BCA (Mengikat Cu sehingga menghasilkan warna.
Bagaimana ikatan BCA dengan ion Cu)?
JAWAB:

Reaksi BCA terjadi oleh mekanisme

berikut: Dalam media alkali, Cu2+
direduksi menjadi Cu+ di situs kompleks
di dalam molekul protein. Lalu kromofor
berwarna berkembang dari kompleks
stabil dan sangat spesifik diketahui
terbentuk antara bicinchoninic acid dan
Cu+ dan spektra serapan diukur dalam
kisaran 450 – 750 nm. Kemudian, BCA
mengikat semua Cu+ yang tersedia
sehingga menghasilkan warna
"berlebihan" sehubungan dengan total
protein.
 BERITA ACARA
5. Perbedaan metode Lowry dengan metode BCA?
JAWAB:
Perbedaan metode Lowry dengan metode BCA:
• Sensitifitas metode BCA sebanding dengan metode Lowry. Dan sensitifitas
mikro BCA (0,5 - 10 mcg lebih baik di banding metode Lowry).
• Teknik dan tahap pencampuran pada metode BCA lebih mudah atau
sederhana dibanding metode Lowry.
• Reagen metode BCA yang di gunakan lebih stabil.
• Adanya deterjen ionik dan garam-garam buffer tidak mengganggu reaksi
pada metode BCA.
• Konsentrasi medium reagen denaturasi (guanidin HCl-4 M/ urea 3 M) tidak
mengganggu penetapan.