Isolasi DNA

Tumbuhan, Hewan, Bakteri

Kelompok 6
Amanah M I (1703093)
Dwi Lestari D (1700622)
Miftah Agung F (1704248)
Putu Chandra S (1700518
Biologi C 2017
 Pendahuluan
Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya
berada (ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi
dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah
DNA rusak (Yuwono, 2008).
Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran
(lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti
selulosa dan protein, serta pemurnian DNA sehingga nantinya akan
terbentuk ekstrak sel yang terdiri dari DNA dan RNA (Corkill dan
Rapley, 2008).
Tahap Isolasi DNA :
1. Isolasi Jaringan
2. Pelisisan dinding sel dan membran sel
 dengan cara penggerusan (homogenasi) sehingga nanti
dinding sel dan membran sel akan lisis.
3. Pengektrasian dalam larutan
 memisahkan senyawa DNA dari protein dan lipid.
4. Purifikasi ( Pemurnian)
 membersihkan hasil ekstrak dari zat-zat lainnya.
5. Presipitasi
 bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga
untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan
dengan protein histon, sehingga DNA menjadi terlihat.
 Tujuan
1. Mengetahui cara mengisolasi DNA tumbuhan, hewan dan
bakteri.
2. Mengetahui hasil elektroforesiss DNA tumbuhan, hewan
dan bakteri.
3. Menghitung konsentrasi DNA dan Rasio DNA tumbuhan,
hewan, bakteri.
4. Mengetahui faktor-faktor yang mempengaruhi kuantitas
dan kualitas DNA hasil isolasi.
 Alat & Bahan
No. Nama Alat Jumlah
Mikropipet (0,5-20 μl, 20-200 μl, 200-1000 Masing-masing 1
1.
μl) unit
2. Tips Steril 1000 μl, 200 μl, 20 μl Secukupnya
3. Microtube 1,5 ml Secukupnya
4. Tisu steril Secukupnya
1. Isolasi
5. DNA Centrifuge 1 unit
6. Tabel 1.1. Alat yang Digunakan Untuk Isolasi DNA1 unit
Micropestle
7. Jarum Inokulasi 1 unit
No. Nama Bahan Jumlah
Daun tanaman selada bokor (Lactuca
1. Secukupnya
sativa)
2. Kultur Bakteri Escherichia coli Secukupnya
3. Drosophila sp. 3-4 ekor
4. Buffer ekstraksi (SDS 1%, NaCl 0,5 M) 5 ml
5. Reagen presipitasi (Isopropanol) 5 ml
6. Reagen pencuci (Ethanol 70%) 5 ml
7. ddH2O 10 ml
8. Es Batu
Tabel 1.2. yang
Bahan dihaluskan
yang Digunakan Untuk Secukupnya
Isolasi DNA
 Tabel 2.1. Alat yang Digunakan Untuk Uji Kuantitatif DNA

No. Nama Alat Jumlah

1. Mikropipet (0,5-20 μl, 20-200 μl, 200-1000 μl) Masing-masing 1 unit
2. Tips Steril 1000 μl, 200 μl, 20 μl Secukupnya
3. Microtube 1,5 ml Secukupnya
4. Tisu steril Secukupnya
5. Spektrofotometer 1 unit
6. Kuvet 1 unit
2. Uji Kuantitatif DNA
 Tabel 2.2. Bahan yang Digunakan Untuk Uji Kuantitatif DNA

No. Nama Alat Jumlah

Hasil isolasi DNA daun tanaman selada
1. 5 μl
bokor (Lactuca sativa)
2. Hasil Isolasi DNA bakteri Escherichia coli 5 μl
3. Hasil Isolasi DNA Drosophila sp. 5 μl
4. Larutan Deion 1 ml
5.. Es Batu yang dihaluskan Secukupnya
 Tabel 3.1. Alat yang Digunakan Untuk Uji Kualitatiff DNA

No. Nama Alat Jumlah

1. Mikropipet (0,5-20 μl) 1 unit
2. Tips Steril 20 μl Secukupnya
3. Microtube 1,5 ml Secukupnya
4. Elektroforesis 1 unit

3. Uji Kulitatif DNA

 Tabel 3.2. Bahan yang Digunakan Untuk Uji Kualitatiff DNA

No. Nama Alat Jumlah

Hasil isolasi DNA daun tanaman selada
1. 5 μl
bokor (Lactuca sativa)
2. Hasil Isolasi DNA bakteri Escherichia coli 5 μl
3. Hasil Isolasi DNA Drosophila sp. 5 μl
4. Gel Agarose Secukupnya
5. Loading dye Secukupnya
 Langkah Kerja
1. Isolasi DNA Tumbuhan

1. Isolasi DNA
Tumbuhan

Bagan Alir 1. Langkah Kerja Isolasi DNA Tumbuhan

2. Isolasi DNA Hewan

2. Isolasi DNA
Hewan

Bagan Alir 2. Langkah Kerja Isolasi DNA Hewan

3. Isolasi DNA Bakteri
a. Secara Direct Bakteri E.coli yang terdapat pada Bakteri yang sudah diambil,
cawan petri diambil dengan dipindahkan ke dalam
menggunakan jarum inokulasi microtube

3. Isolasi DNA
Bakteri
a. Secara Direct

Bagan Alir 3.a Langkah Kerja Isolasi DNA bakteri secara direct
b. Secara Indirect + Sentrifuge

Bagan Alir 3.b Langkah Kerja Isolasi DNA bakteri secara Indirect + Sentrifuge
c. Secara Indirect

Bagan Alir 3.c Langkah Kerja Isolasi DNA bakteri secara Indirect
4. Uji Kuantitatif DNA

5 µl Isolasi DNA dari Tambahkan de-ion

tumbuhan, hewan dan sebanyak 495 µl dan
bakteri diambil. pindahlan kemudian homogenkan
ke microtube baru menggunakan micropipet

Tekan tombol agar Masukkan homogenat

dilakukan kedalam kuvet
Lakukan berulang
pembacaan dengan spektofotometer.
sebanyak 3 kali
panjang gelombang bersihkan sekeliling kuvet
A260 dan A280 agar hasil terlihat jelas

Bagan Alir 4. Langkah Kerja Uji Kuantitatif DNA

5. Uji Kualitatif DNA
0.375 gr agarose dimasukkan Campuran
Gel agarose
dalam buffer TAE 1x sebanyak dihomogenkan
Gel dimasukkan kedalam
25 µl, sehingga diperoleh menggunakan
didinginkan tray yang sudah
konsentrasi agarose sebesar 1- microwave selama 45
disiapkan
2% detik - 1.5 menit

Sampel Loading Dye

Alat dipasangkan Dimogenkan Gel dibiarkan
dimasukkan ke ditambahkan ke
dan disambungkan dengan cara mengeras selama 45
dalam sumur yang dalam sampel
ke sumber listrik pipetting menit - 1 jam
terdapat dalam gel sebanyak 1 µl

dielektroforesis Dilakukan pewarnaan

Direndam dalam Divisualisasi
pada daya 100 dengan cara
aquades selaa 10- menggunakan
volt selama 30 ditambahkan EtBr
15 menit sinar UV
menit sebanyak 500 ml

Bagan Alir 5. Langkah Kerja Uji Kualitatif DNA

6. Pembuatan Reagen

Dihitung berapa ml
Disimpan pada
SDS 5% , NaCl 5M, Buffer larutan yang
botol atau tube
Ekstrasi, Isopropanol dan dibutuhkan lalu
falcon yang
Etanol 70% disiapkan dilarutkan dengan
telah disediakan.
aquades

Bagan Alir 6. Langkah Kerja Pembuatan Reagen

 Hasil Pengamatan
1. Pembuatan Reagen
2. Isolasi DNA Tumbuhan

No. Nama Tumbuhan Hasil Isolasi DNA Keterangan

Daun Lactuca Warna larutan

sativa bening, ada
1.
(Daun Selada endapan berwarna
Bokor) Gambar 2.1 Hasil Isolasi hijau kecoklatan
DNA Tumbuhan
(Dok. Kelompok 6, 2019)
2.a. Hasil Uji Kuantitatif Isolasi DNA Tumbuhan

Cara menghitung konsentrasi DNA = Å260 x 50 x Faktor

Pengenceran
Faktor Pengenceran = Volume total/Volume sampel
Cara menghitung rasio = Å260/Å280
2. b. Hasil Uji Kualitatif Isolasi DNA Tumbuhan

No. Foto Hasil Elektroforesis Keterangan

1. DNA terisolasi

Gambar 2.b.1 Hasil Elektroforesis DNA Tumbuhan

(Dok. Pribadi, 2019)
3. Isolasi DNA Hewan

No. Nama Tumbuhan Hasil Isolasi DNA Keterangan

Warna larutan sedikit

kecoklatan, ada
1. Drosophila sp.
sedikit endapan
Gambar 3.1 Hasil Isolasi DNA berwarna coklat
Hewan
(Dok. Kelompok 6, 2019)
3.a. Hasil Uji Kuantitatif Isolasi DNA Hewan

Cara menghitung konsentrasi DNA = Å260 x 50 x Faktor

Pengenceran
Faktor Pengenceran = Volume total/Volume sampel
Cara menghitung rasio = Å260/Å280
3. b. Hasil Uji Kualitatif Isolasi DNA hewan

No. Foto Hasil Elektroforesis Keterangan

Tidak ada DNA

1.
yang terisolasi

Gambar 3.b.1 Hasil Elektroforesis DNA hewan

(Dok. Pribadi, 2019)
4. Isolasi DNA Bakteri

No. Nama Tumbuhan Hasil Isolasi DNA Keterangan

Warna larutan
1. Escherichia coli bening, tidak terlihat
adanya endapan
Gambar 4.1 Hasil Isolasi DNA
Bakteri
(Dok. Kelompok 6, 2019)
4.a. Hasil Uji Kuantitatif Isolasi DNA Bakteri

Cara menghitung konsentrasi DNA = Å260 x 50 x Faktor

Pengenceran
Faktor Pengenceran = Volume total/Volume sampel
Cara menghitung rasio = Å260/Å280
4. b. Hasil Uji Kualitatif Isolasi DNA Bakteri

No. Foto Hasil Elektroforesis Keterangan

Tidak ada DNA

1.
yang terisolasi

Gambar 4.b.1 Hasil Elektroforesis DNA Bakteri

(Dok. Pribadi, 2019)
 Pembahasan
DNA yang telah diisolasi diuji secara kualitatif dan kuantitatif. Pada uji kualitatif kita menngunakan
metode dengan cara Elektoforesis untuk mengetahui ukuran DNA, sedangkan uji kuantitatif dengan
cara Spektofotometer untuk menguji kemurnian DNA.
1. Isolasi DNA Tanaman
Berdasarkan hasil pengamatan yang telah dilakukan dengan uji spektofotometer pada Panjang
gelombang A260 dan A280, isolasi DNA Lactuva sativa memiliki hasil ratio 1,626 dari Panjang
gelombang A260 = 0,854 dan A280 = 0,525. Hal ini menunjukan bahwa hasil isolasi DNA tidak murni,
karena memiliki nilai ratio yang kurang dari ketetapan standar yaitu 1,8. Kemungkinan hal ini terjadi
karena adanya kontaminan pada saat melakukan tahap proses mengisolasi DNA, kontaminan yang ada
biasanya kontaminan oleh protein yang menyebabkan nilai ratio tidak sesuai.
Ukuran DNA ditentukan berdasarkan hasil elektroforesis yang telah dilakukan pada Lactuva
sativa untuk menentukan ukuran DNA. Pita DNA L. sativa terbaca, namun tidak terlihat jelas dan
hanya terlihat smear dibagian atas. Hal ini bisa terjadi karena adanya kesalahan teknis saat melakukan
isolasi DNA yaitu daun yang dihaluskan masih belum cukup halus sehingga DNA yang diperoleh
terkontaminasi dan menyebabkan pita DNA tipis dan tidak jelas.
2. Isolasi DNA Hewan
Berdasarkan hasil pengamatan yang telah dilakukan dengan uji spektofotometer pada
Panjang gelombang A260 dan A280, isolasi DNA Drosophila sp. memiliki hasil ratio 0,933 dari
Panjang gelombang A260 = 0,056 dan A280 = 0,006. Hal ini menunjukan bahwa hasil isolasi
DNA tidak murni, karena memiliki nilai ratio yang kurang dari ketetapan standar yaitu 1,8.
Kemungkinan hal ini terjadi karena adanya kontaminan pada saat melakukan tahap proses
mengisolasi DNA, kontaminan yang ada biasanya kontaminan oleh protein yang menyebabkan
nilai ratio tidak sesuai.
Ukuran DNA ditentukan berdasarkan hasil elektroforesis yang telah dilakukan pada
Drosophila melanogaster untuk menentukan ukuran DNA. pita DNA Drosophila melanogaster
yang diuji tidak dapat terlihat sama sekali. Mungkin hal ini terjadi karena terlalu sedikit sampel
yang digunakan dan kesalan teknis pada tahap isolasi. Hal ini yang menyebabkan data hasil
isolasi tidak bisa dibaca
3. Isolasi DNA Bakteri Escherichia coli
Berdasarkan hasil pengamatan yang telah dilakukan dengan uji spektofotometer pada
Panjang gelombang A260 dan A280, isolasi DNA Escherichia coli memiliki hasil ratio 1,111 dari
Panjang gelombang A260 = 0,03 dan A280 = 0,027. Hal ini menunjukan bahwa hasil isolasi DNA
tidak murni, karena memiliki nilai ratio yang kurang dari ketetapan standar yaitu 1,8.
Kemungkinan hal ini terjadi karena adanya kontaminan pada saat melakukan tahap proses
mengisolasi DNA, kontaminan yang ada biasanya kontaminan oleh protein yang menyebabkan
nilai ratio tidak sesuai.
Ukuran DNA ditentukan berdasarkan hasil elektroforesis yang telah dilakukan pada
Escherichia coli untuk menentukan ukuran DNA. pita DNA Escherichia coli yang diuji tidak
dapat terlihat sama sekali. Mungkin hal ini terjadi karena terlalu sedikit sampel yang digunakan
dan kesalan teknis pada tahap isolasi. Hal ini yang menyebabkan data hasil isolasi tidak bisa
dibaca.
 Kesimpulan
1. Prinsip dasar mengisolasi DNA memiliki kesamaan, baik saat mengisolasi
DNA tumbuhan, hewan maupun bakteri. Hanya perlakuan awal untuk
mengisolasi DNA bakteri ada tiga, yaitu direct, indirect yang dilanjut
dengan sentrifuge dan indirect tanpa dilanjutkan dengan sentrifuge.
Sedangkan untuk langkah awal isolasi DNA tumbuhan dan hewan sama,
yaitu tumbuk terlebih dahulu tumbuhan atau hewan yang akan digunakan.
2. Dari hasil elektroforesis isolasi DNA, terlihat bahwa isolasi DNA tumbuhan
yang terlihat hasilnya. Sedangkan untuk isolasi DNA hewan dan bakteri
tidak terlihat. Hal ini dapat disebabkan karena berbagai faktor.
3. Konsentrasi dan ratio pada DNA tumbuhan, hewan dan bakteri berbeda.
Pada tumbuhan memiliki konsentrasi 4.27 µg/µl dan ratio (kemurniaan)
1,626. Pada hewan memiliki konsentrasi 0.028 µg/µl dengan ratio 0,933.
Pada bakteri memiliki konsentrasi 0.15 µg/µl dengan ratio 1,111.
4. Ada faktor yang memengaruhi kuantitas dan kualitas dari isolasi DNA
sehingga mempengaruhi kemurniaannya. Salah satu faktor yang sangat
memengaruhi hasil isolasi DNA adalah tingkat kestrelian isolasi yang kita
buat. Apabila isolasi DNA yang dibuat mengalami kontaminasi, maka hasil
yang didapat kurang memuaskan atau bahkan tidak terbaca. Faktor lain
yang memengaruhi adalah jumlah organisme yang akan digunakan.
Seperti contoh pada isolasi DNA Drosophila sp. dimana hasil yang
didapatkan kurang memuaskan, bisa disebabkan karena adanya
kontaminan atau karena jumalh organisme yang digunakan terlalu sedikit.
Thanks!