Identification of metabolic pathway disturbances

using multimodal metabolomics in autistic

disorders in a Middle Eastern population
Anna Fitriawati V180010040
Yunita Cahya A.L.K V180010035
Abstrak

• Menganalisis profil metabolik anak-anak libanon yang terkena gangguan

autis
• Sampel urin dari 40 pasien ASD & 40 Kontrol yang sehat
• Dianalisa menggunakan NMR dan Kromatografi cair serta LC-MS
• Spesifitas 86% & Sensitivitas 80%
• Metabolit yang berkontribusi pada gangguan tyrosine, 2-hydroxybutyrate,
creatine dan guanine.
• Asam amino, karbohidrat, dan jalur stres oksidatif
Pendahuluan

• Autism Spectrum Disorder (ASD) adalah sekelompok

gangguan perkembangan saraf yang ditandai oleh
gangguan komunikasi dan interaksi sosial
• Etiologi ASD sebagian besar masih belum jelas meskipun
upaya besar dalam genetika dan neuroimaging. ASD
mungkin gangguan multifaktorial dengan faktor genetik
dan lingkungan.
• Ketidakseimbangan kadar asam amino dalam plasma,
trombosit, urin atau cairan serebrospinal
• Gangguan neurometabolik
Pendahuluan

• Pada beberapa penelitian telah

menunjukkan gangguan metabolisme
pada individu dengan ASD dibandingkan
dengan populasi umum.
• Prevalensi ASD diperkirakan
mempengaruhi sekitar 1 per 160 anak,
menurut organisasi kesehatan dunia, dan
1 per 66 anak-anak di Lebanon.
Platform analitis

• Kromatografi gas GC-MS

• Cair kromatografi (LC-MS)
• NMR
 Tujuan

• Evaluasi metabolisme profil dari air seni

dalam populasi ASD Lebanon dengan
menggunakan saling melengkapi platform
analitis
• NMR
• LC-MS
• Membandingkan profil metabolik spesifik
untuk populasi yang dipelajari
sebelumnya
 Bahan dan Metode

Pengumpulan sampel

Sampel urin 40 anak autis & 40 kontrol

Disentrifugasi pada 2000g selama 5 menit supernatan

Didistribusikan dalam volume 5ml disimpan pada suhu -80⁰C

Analisis kreatinin dengan metode Jaffe

 Persiapan sampel

2mL sampel urin diliofilisasi

300L D20 + 8L TSP

Sentrifugasi 3menit pada 1500g

Supernatan dipindahkan ketabung NMR 3mm

Analisis NMR
 Analisis Spektroskopi NMR

• Dilakukan menggunakan Bruker Advance III HD

• Beroperasi pada 600MHz
• Spektra diperoleh dengan program “noesypr 1d”
dg keterlambatan 20 detik untuk analisa 1D
• Urutan “Hsqcgpphpr” untuk 2D(1H-13C) NMR
 Pemrosesan data untuk NMR yang
ditargetkan

• Spektra terintegrasi dalam jarak 0-10ppm

menggunakan perangkat lunak AMIX
• Identifikasi metabolit dicapai dengan menggunakan
perangkat lunak Chenomx
• Kalibrasi dan Integrasi menggunakan perangkat lunak
MastRenova
• Analisis statistik puncak menggunakan MetaboMiner
database dan database in-house
 LC-HRMS

• 20L urin + 160mL air + 20mL intern standar(Imipramine)

• Vortexing & Sentrifugasi 10000g, 10min,150L
• Kromatografi
• QS dianalisis setiap 10 sampel
• Kualitas data diperiksa oleh komponen utama analisis
PCA
 Analisis LC-HMRS

• Menggunakan sistem UPLC Ultimate 3000 (Dionex)

• Ditambah dengan Q-Spektrometer massa eksaktif
• Dioperasikan secara positif dan negatif
• Pemisahan UPLC dicapai menggunakan Kolom
Phenomenex Kinetex dengan fase diam 0,1% asam
format dalam air dan fase gerak 0,1% dalam
metanol
 Pemrosesan data untuk LC-HMRS

• Anotasi fitur yang dipilih divalidasi dari waktu

retensi, dan tinggi resolusi massa molekul(m/z)
• Molekul yang ditargetkan (367 molekul
terdeteksi di ESI +, 255 di ESI -)
• Dipilih dan diintegrasikan kedalam Xcalibur
 Thermo Fisher

• Setiap area puncak dinormalisasi ke area

puncak total setiap kromatogram
• Koefisien Variasi (CV) untuk sampel QC
dihitung
• Hanya metabolit dengan variabilitas
tinggi yang terpilih
• Di simpan metabolisme dengan CV <
30%, QC >30%
 ANALISIS MULTIVARIAN

• Model fusi data dihasilkan dengan

menggabungkan tabel data dengan
semua fitur diperoleh dari itu empat
analitis metode (NMR1D, NMR 2D, LC-
MS, ESI- dan LC-MS ESI +)
• Dengan menggabungkan data dari matrik
yang berbeda untuk mencapai gambaran
global
• Analisis validasi varian (CV-ANOVA)
• Uji korelasi pearson
Analisis Prediksi

Data dibagi menjadi 2:

 50 sampel (25 ASD dan 25 kontrol yang cocok) yang digunakan
untuk membangun OPLS-Model DA untuk mengidentifikasi
fitur yang signifikan
 30 sampel (15 ASD dan 15 kontrol yang cocok) digunakan
untuk mengevaluasi kinerja model klasifikasi

Lalu uji Univariant  Uji T

 Jalur Metabolisme

• VIP diperoleh dari model OPLS-DA terakhir dan signifikan

• metabolisme disesuaikan uji-t (FDR)
• cara analisis di MetaboAnalyst berdasarkan versi terbaru
KEGG [26],
• diberi analisis jalur metabolik (MetPA).
• tes Hypergeometric.
• nilai p<0,05 dari analisis pengayaan jalur dan
menghapusnya dengan nilai dampak = 0 dari analisis
topologi jalur.
• Perangkat lunak Cytoscape digunakan untuk
memvisualisasikan interaksitions antara jalur metabolisme
yang signifikan (dampak jalur nilai> 0 dan nilai p ≤0.05)
dan metabolitnya.
 Hasil

• Dalam pekerjaan ini, dilakukan studi metabolisme urin pada populasi

ASD Timur Tengah, menggunakan satu set pelatihan, dikonfirmasi oleh
set tes validasi. Kalaupun studi ini diwujudkan pada skala kecil kelompok
(tetapi mirip dengan literatur), kami mengkonfirmasi bahwa metabolit
eral dimodifikasi dalam arah yang sama dalam semua penelitian seperti
serin, kreatin, treonin, hidroksibenzoat, glukuronat, hydroxyproline dan
guanidinosuccinate. Metabolit ini seharusnya divalidasi sebagai
biomarker dengan studi lebih lanjut (pengembangan dan pengesahan tes
kuantitatif pada kohort lain) agar berpotensi digunakan di masa depan
untuk meningkatkan diagnosis ASD. Di samping itu, itu lain metabolisme
kita ditemukan, tidak ada namun dikutip diitu literatur, dapat membuka
perspektif dalam mengidentifikasi patofisiologis spesifik jalur. Kita
dikonfirmasi di Sebuah kuat cara bahwa beberapa metabolisme profil
yang terkait dengan asam amino, metabolisme purin, kreatin
metabolisme, mikrobiota usus, metabolisme energi dan oksida- Stres
dapat terlibat dalam ASD. Temuan-temuan ini menuntun
kamimenyimpulkan bahwa itu mungkin merupakan profil metabolik yang
umum di antara keduanya ASD Lebanon dan populasi lain yang diteliti
terlepas dari perbedaan
Analisis multivariat analisis statistic kombinasi 1 HNMR, 1 H 13C NMR, ESI
+/- kolom 18 C (gb. 1)
 Stres Oksidatif

• Banyak penelitian telah melaporkan bukti stres

oksidatif pada individu dengan ASD.
• Telah ditemukan gangguan di metabolisme yang
terlibat dalam metabolisme glutathione, serta
gangguan pada jalur sistein, metabolisme metionin
dan arginin, dan metabolisme prolin.
• Ditemukan gangguan guanidinosuccinat (N-
amidinoaspartate) yang diperoleh dari oksidasi
arginosuccinat oleh radikal bebas. Gangguan pada
jalur ini dapat mendukung keberadaan kondisi stres
oksidatif pada individu autis.
 Metabolisme Energi

• Defisiensi creatine mungkin berperan dalam neurobiologi

ASD karena berperan penting dalam transfer energi dalam
system saraf pusat (SSP).
• Kadar creatine yang rendah telah dilaporkan terjadi pada
beberapa bagian otak dari pasien ASD.
• Defisiensi kadar asetil karnitin ditemukan pada kelompok
ASD Lebanon dibandingkan dengan kontrol (Tabel 1).
• Asetil karnitin terlibat dalam metabolisme mitokondria dan
berperan dalam oksidasi asam lemak.
• Penelitian telah menunjukkan bahwa suplementasi dengan l-
karnitin meningkatkan fitur perilaku ASD
 Metabolisme Karbohidrat

• Karbohidrat berperan penting sebagai sumber energi untuk sel.

• Beberapa metabolit dalam metabolisme karbohidrat berubah pada populasi
ASD. Terjadi gangguan dalam metabolisme propanoat (gangguan konsentrasi 2-
hydroxybutyrate), sitrat (perturbasi dalam sitrat) dan gula (gangguan dalam
glukosa-1-fosfat, fruktosa, dan glu-kuronat).
• 2-Hydroxybutyrate merupakan asam organik yang terlibat dalam metabolism
propanoat, ditemukan berubah pada anak-anak populasi ASD.
• Butirat diproduksi oleh bakteri di usus besar dan berperan dalam produksi
energi. Penelitian telah menemukan bahwa sumber makanan dari butirat
memiliki efek yang menguntungkan pada pasien dengan gangguan otak.
• Sumber energi utama dalam siklus asam sitrat adalah asetil-KoA yang berasal
dari glikolisis piruvat melalui piruvat dehidroge-nase.
• Dehidrasi piruvat dehidrogenase adalah neurometabolic disorder langka yang
dapat menyebabkan masalah neurologis yang terkait dengan perkembangan
kecacatan intelektual dan kejang
 Metabolisme Asam amino

• Konsentrasi asam amino dapat dipengaruhi oleh banyak faktor seperti

usia, jenis kelamin, tahap perkembangan, diet, kebiasaan makanan.
• Penyebab fluktuasi antar studi masih belum jelas. Hasil kami menunjukkan
bahwa beberapa asam amino seperti serin, glutamat, tirosin, treonin
berubah pada ASD Lebanon, seperti yang dijelaskan sebelumnya. Sebagai
contoh, N-acetyl-l-phenylalanine, metabolit fenilalanin, andtyrosine,
produk hidroksilasi fenilalanin, ditemukan berbeda dalam urin ASD
Lebanon.
• l-glutamat adalah neurotransmitter rangsang terbesar di otak, memiliki
fungsi dalam proses belajar, memori dan plastisitas sinaptik.
• Pada studi telah menunjukkan peran penting dari asam amino ini dalam
patofisiologi ASD. Pada ASD kadar glutamat di otak dan plasma lebih tinggi.
• Peningkatan pada ekskresi glutamat tidak dijelaskan dengan jelas, tetapi
bisa disebabkan oleh balita, diet, keterlibatan vitamin B6 atau gangguan
pada glutamat atau transkompreser atau reseptor.
 Metabolisme Purin

• Ditunjukkan perubahan dalam metabolisme purin.

• 5-Aminoimidazole-4-carboxamide hasil sintesis metabolit purin dan guanin
ditemukan telah berubah dalam urin populasi ASD.
• Defisiensi adeny-losuccinase adalah gangguan bawaan metabolisme purin, yang
berakibat pada akumulasi amino imidazole carboxamide dan succinyladenosine
dalam cairan tubuh.
• Gejala yang terjadi adalah adanya keterlambatan perkembangan mental, epilepsi
dan autism. Defisiensi Enzyme nukleosida fosforilasa (PNP) untuk metabolisme
purin seperti guanin, dapat menyebabkan masalah neurologis termasuk
keterlambatan perkembangan dan cacat intelektual
 Kesimpulan

• Studi metabolisme urin pada populasi ASD Timur Tengah,

menggunakan set pelatihan, yang dikonfirmasi oleh set tes
validasi.
• Beberapa metabolit dimodifikasi pada arah yang sama di semua
studi seperti serin, kreatin, treonin, hydroxybenzoate,
glucuronate, hydroxyproline dan guanidinosuccinate. . Metabolit
ini harus divalidasi sebagai biomarker oleh penelitian lebih lanjut
(mengembangkan dan memvalidasi tes kuantitatif pada kohor
lain) untuk berpotensi digunakan di masa depan untuk
meningkatkan diagnosis ASD.
• Beberapa profil metabolic yang terkait dengan asam amino,
metabolisme purin, metabolisme kreatin, mikrobiota usus,
metabolisme energi dan stres oksidatif dapat terlibat dalam ASD.
• Temuan-temuan ini menuntun untuk menyimpulkan bahwa profil
metabolik yang umum di antara keduanya ASD Lebanon dan
populasi lain yang diteliti terlepas dari perbedaannya.