BIOLOGI SEL DAN MOLEKULER

ISOLASI DNA&RNA
 KELOMPOK 1

• I Putu Adi Wirambawa ( P07134018057 )

• Trisna Bagus Wibawa
• Ni Putu Sinta Wirawati
• Ni Komang Anis Septiari
• Ni Putu Puspa Trisnawati
• Ni ketut Budiasih
( P07134018061 )
( P07134018070 )
( P07134018074 )
( P07134018077 )
( P07134018079 )
 DNA Isolation

Merupakan teknik dasar yang harus dikuasai dalam teknologi DNA

rekombinan. Tujuan isolasi adalah mendapatkan DNA tanpa debris sel
 Prinsip teknik isolasi DNA.

Tahap pertama adalah penghancuran dinding sel

Tahap kedua adalah lisis sel.

Tahap ketiga adalah membersihkan debris sel.

• Pemisahan DNA dapat dilakukan dengan mengambil supernatan
cairan hasil tahap ini dan dapat dipresipitasi dengan penambahan
alkohol. Untuk keperluan rekayasa genetika, ahli rekayasa genetika
biasanya menyiapkan paling sedikit dua jenis DNA yang berbeda,
yaitu DNA obyek penelitian dan DNA vektor sebagai perantara.
• DNA plasmid mempunyai struktur yang sangat ketat yang dikenal
dengan covalenthy closed circular (ccc). Struktur yang sama juga
dimiliki oleh DNA mitokondria. Sedangkan DNA kromosom
mempunyai struktur yang lebih longgar dan mempunyai ukuran
yang sangat panjang.
• Perbedaan struktur ini dapat digunakan untuk memisahkan
berbagai jenis DNA tersebut melalui proses denaturasi dan
pemisahan dengan gradien densitas sentrifuga.
• Selain teknik isolasi DNA, juga harus menguasai teknik isolasi gen. Teknik ini
secara sederhana dapat dipelajari dari proses isolasi gen bakteri E. coli.
Teknik ini diawali dengan fragmentasi sel bakteri dan mengisolasi kromosom.
Selanjutnya DNA dipotong dengan berbagai enzim restriksi. Hasil reaksi ini
adalah berbagai fragmen DNA. Selanjutnya fragmen tersebut dicampur
dengan DNA plasmid E. coli yang telah dipotong dengan enzim restriksi
tertentu. Kemudian tambahkan enzimn ligase untuk mengkatalis reaksi
penyambungan fragmen DNA dan DNA vektor. Hasilnya adalah berbagai
molekul DNA rekombinan dalam bentuk siklik.
• Komponen utama kromosom pada eukariota adalah molekul DNA dan
protein histon. Protein histon ini bersifat basa sehingga dapat menetralkan
sifat asam dari DNA. Pada dasarnya sel mengandung dua asam nukleat, yaitu
RNA dan DNA. DNA yang dijumpai di nucleus disebut DNA kromosomal,
DNA lain yang terdapat dalam sel di luar nucleus yaitu DNA mitokondria,
DNA kloroplas, DNA plasmid, ketiganya disebut DNA ekstrakromosomal.
• Proses denaturasi dan renaturasi molekul DNA tergantung pada banyak
factor. Seperti temperature, T-melting (Tm) yang tinggi menyebabkan untai
ganda DNA akan terurai menjadi untai tunggal, tetapi bila temperature ini
diturunkan secara perlahan maka terjadi renaturasi menjadi untai heliks ganda
DNA seperti semula.
Pemecahan dinding bakteri dapat dilakukan
dengan 2 cara, yaitu :

Secara • sel dipecah dengan kekuatan mekanik

atau resonasi
fisik
Secara • sel dirusak dengan buffer lisis berisi
senyawa kimia yang dapat merusak
kimiawi integritas barrier dinding sel
• Presipitasi akhir DNA dapat dilakukan dengan menggunakan ethanol yang
dingin dibawah kondisi ionic yang kuat. Dan dicuci dengan EtOH 70%.
Pellet DNA dilarutkan dengan buffer TE atau ddH2O steril.
 Preparasi DNA bacteriophage atau virus

• Preparasi DNA bacteriophage atau viru, sedikit agak berbeda dengan sel-sel
bakteri, yaitu Phage diisolasi dari kultur sel-sel yang terinfeksi, dilakukan
sentrifugasi dengan ultra sentrifugasi, sampai diperoleh supernatant berisi
phage dan terpisah dari kultur selnya (dalam bentuk endapan atau pellet).
Tambahkan PEG (poli ethilen glikol) + NaCl untuk presipitasi partikel
phage, sentrifugasi dan diperoleh pellet phage murni.
 DNA dari sel-sel atau jaringan tanaman

• Sedangkan preparasi DNA dari sel-sel atau jaringan tanaman yang harus
diperhatikan adalah jaringan tenaman diperlakukan terlebih dahulu dalam
Nitrogen cair (NO2) dan segera dilakukan penggerusan agar diperoleh
ekstrak sel yang halus. Kemudian ekstrak sel diperalukan dengan ekstrak
buffer yang dicampur denan b-merkaptoethanol dan jaringan atau organisme
yang lain.
 RNA Isolation

• Isolasi RNA messenger (mRNA) adalah salah satu teknik dasar biologi
molekular yang digunakan untuk mengetahui ekspresi suatu gen baik pada
hewan maupun tumbuhan. RNA messenger adalah hasil transkripsi DNA
dengan tujuan untuk ditranslasi menjadi protein.
• Banyak sekali faktor yang mempengaruhi kuantitas dan kualitas RNA yang
dihasilkan ketika ektraksi / isolasi RNA dilakukan pada jaringan tumbuhan.
Ekstraksi RNA tumbuhan dari sampel daun akan memberikan hasil yang
lebih besar daripada akar dan batang. Keberadaan senyawa karbohidrat,
fenolik, antosianin, atau metabolit lain juga dapat menurunkan RNA yang
dihasilkan baik dalam segi kuantitas maupun kualitas
• Prinsip Isolasi RNA sebenarnya tidak jauh berbeda dengan isolasi DNA yang
sudah dijelaskan dalam tulisan sebelumnya di “Ekstraksi DNA“. Prinsip
isolasi RNA meliputi tiga hal, yaitu: Ekstraksi RNA, Pemurnian RNA,
dan Presipitasi RNA. Isolasi RNA dapat dilakukan dengan mudah
menggunakan Kit Isolasi RNA. Penggunaan Kit Isolasi RNA memberikan
hasil isolat RNA yang lebih murni dari kontaminan dan dari degradasi RNA.
Setelah dilakukan isolasi RNA, maka tahapan selanjutnya
yakni karakterisasi molekular suatu gen yang dapat
dilakukan dengan langkah berikut:
Terima kasih