• Cromatografía
• ELECTROFORESIS
• ADN Recombinante
INTRODUCCIÓN Arne Tiselius
1937
ELECTROFORESIS (Nobel 1948)
Separar y analizar moléculas: proteínas
ADN/ARN
ELECTROFORESIS LIBRE
moléculas en disolución o suspensión:
poco resolutiva
SOPORTE ánodo
ELECTROFORESIS DE ZONA
SOPORTE que retiene las moléculas:
elevado poder de resolución
cátodo
EQUIPO ELECTROFORÉTICO
fuente de cable Componentes:
alimentación
(E. vertical)
tampón
FACTORES QUE AFECTAN A LA ELECTROFORESIS
1_ Campo eléctrico
*Diferencia de potencial: voltaje (V-voltios)
*Intensidad (A-amperios): flujo de carga eléctrica
depende de V y de R (Ley de Ohm V=RxI)
*Resistencia (R-ohmios): determinada por el soporte y tampón
electroforesis
*Temperatura: efecto Joule refrigerantes
2_ Muestra
*Carga o densidad de carga: carga eléctrica/masa de la molécula
*Tamaño
*Forma: formas globulares avanzan más
3_ Tampón de electroforesis
*pH: determina la carga de las moléculas
generalmente es ligeramente básico moléculas (-)
*Fuerza iónica: moderada (0.05 o 0.1 M) para que no interfiera
4_ Soporte
SOPORTE ELECTROFORÉTICO
Características
Electroforesis horizontal
muestra
Strip
Campo eléctrico (∆ V)
1. Aplicación de la muestra
2. Electroforesis
3. Detección por tinción:
Azul de Coomassie
Negro amido
4. Densitometría
Canine: Leishmaniosis
Electroforesis vertical
Aplicaciones:
* Separar proteínas
* Determinar peso molecular de una proteína SDS-PAGE
* Separar proteínas oligoméricas
• SDS: detergente aniónico (-), dota a todas las proteínas de carga (-)
todas migrarán hacia el ánodo (+), separándose sólo por tamaño
- - - -
-
+ SDS - -- - -
- - - - - - - --- - --
- S-S - S-S - - - -
44 kDa
- - S-S -- -
S-S
S-S
S-S
PM = 50 kDa
+ SDS
+ DTT - --- - - -
- - - - - - --- - 25 kDa
SDS-PAGE: determinación del peso molecular
A B A
0 + 0 pH 6
B Prot A pI=6
0 pH 7 Prot B pI=7
pH 10
(básico)
- - -
ELECTROFORESIS 2D
1ª DIMENSIÓN 2ª DIMENSIÓN
ELECTROFORESIS 2D
WESTERN BLOT
* Técnica immunológica interacción PROTEÍNA-PROTEÍNA (Ag-Ac)
* Detectar en una mezcla una proteína concreta mediante el uso de
anticuerpos específicos (muy sensible)
1. SDS-PAGE Electroforesis
proteínas proteínas
2dario
proteína
HRP interés
1ario
Resultado
SDS-PAGE Western BLOT
4. Revelado
SUSTRATO
proteína
HRP
interés PRODUCTO LUZ
SDS-PAGE:
Resultado
SDS-PAGE Western BLOT
WESTERN BLOT:
Soporte: (restrictivo)
Aplicaciones:
* Secuenciación de DNA
* Identificación de regiones de unión a Gel de poliacrilamida
proteínas
Electroforesis horizontal
muestra (-)
+ -
Campo eléctrico (∆ V)
Electroforesis horizontal
muestra (-)
+ -
Campo eléctrico (∆ V)
Resultado
Gel Agarosa Southern BLOT
4. Revelado
DNA
interés
32
P
Resultado
Gel Agarosa Northern BLOT
4. Revelado
RNA
interés
32
P
http://sebbm.bq.ub.es/BioROM/contenido/biomodel/lab/acetato/inicio.htm
- En gel de poliacrilamida
http://biomodel.uah.es/lab/sds-page/inicio.htm
- En gel de agarosa:
http://biomodel.uah.es/biomodel-misc/anim/elfo/gel_electrophoresis.swf
http://biomodel.uah.es/biomodel-misc/anim/elfo/electrof.html