FUSI PROTOPLAS

(HIBRIDISASI SOMATIK)
merupakan alternatif teknologi yang dapat
diterapkan untuk mengatasi transformasi sifat
yang disandi oleh :
•banyak gen yang terletak di dalam satu
kromosom atau pada beberapa kromosom
tanaman
•gen sangat sulit diidentifikasi dan diisolasi
 KELEBIHAN FUSI PROTOPLAS
• Dapat mengadakan hibridisasi somatik antar
spesies, genus dan familia (dalam kondisi
alamiah, jika kekerabatan beda jauh dipotong
nuklease)
• Dapat mengadakan hibridisasi antar tanaman
yang tidak kompatibel
• Dapat mentransfer gen sitoplasma
• Dapat terjadi rekonstruksi sitoplasma dan inti
 KELEMAHAN FUSI PROTOPLAS
• Dapat terjadi eliminasi kromosom atau
fragmen DNA
• Variasi genetik tinggi
• Terjadi khimera ( layer-layer pada titik
tumbuh tanaman mempunyai jumlah
kromosom yang beda)
• Tidak dapat dipastikan karakter yang
diinginkan terekspresi setelah difusi
• Regenerasi protoplas hasil fusi sulit dilakukan
 Variabilitas hasil fusi
• Sub-kultur yang terus menerus
• Ketidakstabilan kombinasi inti
• Segregasi dan rekombinasi gen sitoplasma
• Tahap siklus sel yang berbeda pada setiap
individu protoplas
 Jenis fusi protoplas
• Fusi simetris : protoplas + protoplas
• Fusi asimetris :
• Protoplas + sub protoplas
• Sub protoplas + sub protoplas
• Protoplas + mikroprotoplas
• Sub protoplas : sitoplasma, inti, kloroplas,
mitokhondria
• Mikroprotoplas : kromosom
Fusi protoplas
• tanaman hasil fusi dapat berupa tanaman
dengan sifat-sifat gabungan dari kedua
tetuanya termasuk sifat-sifat yang tidak
diharapkan terutama berasal dari spesies liar.
• Oleh karena itu, untuk menghilangkan sifat-
sifat yang tidak diinginkan tersebut maka
perlu dilakukan silang balik (back cross)
dengan tetua budi daya
Faktor yang menentukan keberhasilan
• Genotipe
• jaringan yang digunakan,
• fisiologi jaringan,
• jenis dan konsentrasi enzim,
• masa inkubasi,
• media kultur,
• zat pengatur tumbuh, dan
• kondisi inkubasi
 Protoplas
• dapat diisolasi dari hampir semua bagian
tanaman, seperti akar, daun, nodul akar,
koleoptil, kultur kalus dan daun in vitro
• Tergantung spesies
• Organ dari in vitro lebih menguntungkan :
• Steril
• Tersedia kontinyu
• Lingkungan tumbuh konstan
• Jaringan dalam kondisi juvenil
• Pada umumnya dilakukan secara enzimatis.
• Jenis dan konsentrasi enzim sangat bervariasi
seperti selulase R-10, pektinase Y-23,
maserozym, dan hemiselulase
ISOLASI PROTOPLAS
 ISOLASI TIDAK LANGSUNG
A. ISOLASI INDIVIDUAL SEL
• Dengan menambahkan macerozym
(pektinase) dan manitol (sebagai osmotikum)
• Sel menjadi terpisah
• Disaring, disentrifugasi, ditambah manitol
• Sel benar-benar terisolasi
B. ISOLASI PROTOPLAS DARI INDIVIDU SEL :
• Ditambah selulase dan manitol
• Sentrifugasi
• Pelet ditambah sukrosa untuk mengapungkan
• Sentrifugasi
• Protoplas terapung
• Dipipet
• Diendapkan , dicuci dengan sentrifugasi
• Diukur kerapatannya.
 ISOLASI LANGSUNG
• Daun steril ditambah larutan maserozym, selulase,
sorbitol
• Inkubasi
• Saring, sentrifugasi
• Pelet ditambah sukrosa
• Sentrifugasi
• Protoplas terapung
• Pipet
• Cuci dengan sorbitol
 A. Plantula kentang;
B. Daun dari A dipotong-potong;
C. Potongan daun C diinkubasikan dalam medium plasmolisis selama 1-8 jam
selanjutnya diinkubasikan dalam medium enzym selama 4-16 jam;
D1. Protoplasma dalam C disaring dengang filter steril, mess 63 mikron ;
D2. Suspensi protoplasma disentrifuge;
E. Pelet diresuspensi dalam medium pengapung (flotation) 10 ml ditambah
medium pencuci 1 ml selanjutnya disentrifuge, protoplasma akan
melayang-layang diantara medium flotasi dan medium pencuci;
F. Protoplasma diresuspensi lagi dengan medium CPW 13 M dengan
kerapatan 1x 106 per mililiter;
G. 1. Protoplasma diteteskan pada tengah-tengah cawan petri steril
ditambahkan dengan satu tetes minyak mineral; 2. Tetesan tersebut
ditutup menggunakan gelas penutup steril; 3. Tambahkan 3 tetes dari
setiap macam suspensi protoplasma;
H. Protoplas difusikan secara bertahap menggunakan medium fusagen PEG
22,5 dengan cara meneteskannya sebanyak 6 tetes;
I. Protoplasma dicuci dengan medium pencuci Ca+ . Medium pencuci
dicampur dengan medium kultur;
J. Protoplasma diinkubasikan di bawah sinar pada suhu 25o C;
K. setelah 2-3 minggu koloni multiseluler diembeding dengan agarose;
L. Koloni seluler pada K ditanam pada medium MS basal
 INDUKSI FUSI PROTOPLAS
1. Secara spontan : dengan adanya plasmodesma
2. Secara kimia
• Diinduksi oleh asam lemak
• Diinduksi oleh polyenil alkohol
• Diinduksi oleh Ca++ dan ph tinggi (7,5 – 10)
• Diinduksi oleh PEG
3. Secara fisik
• Diinduksi arus listrik
• PEG berfungsi sebagai bulking agent, yaitu
sebagai jembatan antar protoplas yang mirip
fungsinya dengan plasmodesmata.
• Terjadinya fusi semakin besar pada saat
proses penghilangan PEG, yaitu pada saat
pencucian
 Faktor yang mempengaruhi
• konsentrasi PEG yang digunakan,
• masa inkubasi dalam larutan PEG,
• jumlah kerapatan protoplas yang akan
difusikan
 Fusi secara fisik
• menggunakan aliran listrik pada alat yang
dilengkapi dengan generator AC dan DC.
• Generator AC berfungsi untuk membuat
protoplas berjajar membentuk rantai lurus,
• pulsa DC pada tegangan tertentu dapat
menginduksi terjadinya fusi karena pulsa DC
dapat membuat celah yang dapat balik
sehingga protoplas dapat berfusi
 Kemungkinan fusi
• homofusi,
• heterofusi,
• tidak berfusi.

• Metode elektrofusi sangat baik untuk fusi

protoplast, sebab banyak menghasilkan
heterofusi
 Possible Result of Fusion of Two
Genetically Different Protoplasts

= chloroplast

= mitochondria
Fusion
= nucleus

heterokaryon

cybrid hybrid cybrid

hybrid
Chip fusi sel elektrik
Sequential proses fusi sel
Fusi protoplas padi
Fusi protoplas kentang
Production and genetic characterization of somatic hybrids between leaf mustard (Brassica juncea) and
broccoli (Brassica oleracea)
Yu-Ji Lian, Guang-Zhe Lin, +1 author Hak-tae Lim
Published in In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant 2011
Inter-specific somatic hybrids of leaf mustard (Brassica juncea) and broccoli (Brassica oleracea) were
established to introduce cytoplasmic male sterility (CMS) and Verticillium dahliae Kleb. resistance from
broccoli to leaf mustard. Protoplasts isolated from hypocotyls and cotyledons of inbred lines of leaf
mustard and broccoli were fused using 40% (w/v) polyethelene glycol.
Plants regeneration from fusion products. a Protoplasts of
cv. Guoshanxiang (AAB); b Protoplasts of cv. Mas (AA); c
Two protoplast adhere; d–f The process of two protoplasts
fusion; g Fusion products
Fusion of gentian protoplasts. a Embryogenic cell suspension of G. cruciata and (b) its " white " protoplasts, c
shoot culture of G. tibetica and (d) " green " leaf mesophyll protoplasts, e " pearl chain " formation in AC
electric field mixture of " white " and " green " protoplasts after DC pulse, f newly formed heterokaryons, g a
single heterokaryon before and h after cytoplasmic mixing, i an increase in heterokaryon cell volume 1 week
after fusion, j asymmetric heterokaryon division after 2 weeks in culture, k a multicellular hybrid aggregate
after 3 weeks of culture, l granular embryogenic callus, m regenerating somatic embryo, n embryo