Anda di halaman 1dari 37

Uji molisch

Uji ini dilakukan untuk mengidentifikasi semua jenis


karbohidrat. Monosakarida, disakarida, dan polisakarida
akan memberikan hasil positif. Uji positif akan timbul
cincin merah ungu yang merupakan kondensasi antara
furfural atau hidroksimetil furfural dengan α-naftol dalam
pereaksi molisch.
Prinsip dari reaksi ini adalah dehidrasi senyawa
karbohidrat oleh asam sulfat pekat. Dehidrasi pentosa
akan menghasilkan senyawa hidroksimetil dan dehidrasi
pentosa akan menghasilkan senyawa furfural.
Cara kerja uji molisch
1. 15 tetes larutan uji dimasukkan kedalam tabung reaksi
2. 3 teteh pereaksi molisch ditambakan dan dicampur
dengan baik
3. Tabung reaksi dimiringkan lalu dialirkan dengan hati-
hati 1 mL Asam Sulfat pekat melalui dinding tabung
agar tidak tercampur
4. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya cincin
berwarna ungu pada batas antara kedua lapisan
Uji benedict
Uji yang dilakukan untuk mengetahui kandungan gula
pereduksi (yang memiliki gugus aldehid/keton bebas).
Gula pereduksi meliputi semua jenis monosakarida dan
beberapa disakarida seperti laktosa, glukosa dan
maltosa. Uji positif ditandai dengan terbentuknya
endapan merah bata, kadang disertai dengan larutan
yang berwarn ahijau, merah atau orange.
Prinsip dari uji benedict ini adalah gula pereduksi akan
mereduksi ion Cu2+ dalam suasana alkalis menjadi Cu+
yang mengendap sebagai Cu2O berwarna merah bata
Cara kerja uji benedict
1. 3 tetes sampel (larutan) dimasukkan kedalam tabung
reaksi
2. 2mL perekasi benedict ditambahkan, dikocok
3. Dimasukkan kedalam penangas air selama 5 menit
4. Perubahan warna endapan diamati
5. Pembentukkan warna endapan hijau, kuning atau
merah menunjukkan reaksi positif karbohidrat
Uji seliwanoff
Uji yang dilakukan untuk mengetahui adanya ketosa.
Pada pereaksi seliwanoff, terjadi perubahan oleh HCl
panas menjadi asam levulinat dan 4-hidroksimetil furfural.
Jika dipanaskan karbohidrat ketosa ajan menghasilkan
warna merah pada larutannya.
Prinsip dari reaksi ini adalah dehidrasi fruktosa oleh HCl
pekat menghasilkan hidroksimetilfurfural dan dengan
penambahan resorsinol akan mengalami kondensasi
membentuk senyawa kompleks berwarna merah oranye
Cara kerja uji seliwanoff
1. 5 tetes larutan uji dan 15 tetes pereaksi seliwanoff
dimasukkan kedalam tabung reaksi
2. Tabung dididihkan diatas api kecil selama 30 detik
atau dalam penangas air mendidih selama 1 menit
3. Hasil positif ditandai dengan terbentuknya larutan
berwarna merah orange
Uji barfoed
Uji ini dilakukan untuk membedakan monosakarida dan
disakarida dengan mengontrol kondisi-kondisi percobaan,
seperti pH dan waktu pemanasan. Karbohidrat akan
direduksi pada suasana asam. Monosakarida akan
memberikan hasil positif karena lebih mudah mereduksi,
namun disakarida dapat menghasilkan hasil positif bila
dipanaskan cukup lama hingga terjadi hidrolisis
Prinsip dari uji ini adalah ion Cu2+ dari pereaksi barfoed
dalam suasana asam akan direduksi lebih cepat oleh gula
reduksi monosakarida yang ditunjukkan dengan endapan
Cu2O yang berwarna merah bata
Cara kerja uji barfoed
1. 1mL larutan uji dimasukkan kedalam tabung reaksi
2. 1mL pereaksi barfoed ditambahkan, dikocok
3. Tabung dimasukkan kedalam penangas air selama 3 menit
4. Didinginkan dalam air mengalir
5. Bila tidak terjadi reduksi selama 5 menit, lakukan
pemanasan selama 15 menit sampal terjadi reduksi
UJI IODIUM
Uji ini dulakukan untuk mengidentifikasi polisakarida. Uji iod juga
dapat membefakan amilum dengan nitrogen. Reaksi antara
polisakarida dengan iodin membentuk rantai poliiodida.
Polisakarida umumnya membentuk rantai helix (melingkar),
sehingga dapat berikatan dengan iodin, sedangkan karbohidrat
berantai pendek seperti disakarida tidak membentuk struktur helix
sehingga tidak dapat berikatan dengan iodin
Prinsip dari uji ini adalah polisakarida dengan penambahan iodium
akan membentuk kompleks adsorpsi berwarna yang spesifik.
Amilum/pati dengan iodium menghasilkan warna biru, dekstrin
menghasilkan warna merah anggur, sedangkan glikogen dan
sebagian pati yang terhidrolisis akan menghasilkan warna coklat
Cara kerja uji iodium
1. 3 tetes larutan uji dimasukkan kedalam tabung reaksi
2. Ditambahkan 2 tetes larutan iodium
3. Diamati perubahan warna yang terjadi
Uji antron
Dilakukan untuk menguji adanya karbohidrat dalam
sampel yang akan menghasilkan warna hijau atau hijau
kebiruan. Uji antron sangat sensitif sehingga dapat
menghasilkan uji positif jika dilakukan pada kertas saring
yang menganduk selulosa. Uji ini sudah dikembangkan
untuk uji kuantitatif secara kolometrik bagi glikogen, inulin
dan gula dalam darah
Cara kerja uji antron
1. 0,2mL larutan sampel dimasukkan dalam tabung reaksi
2. Ditambahkan kedalam larutan antron (0,2% dalam H2SO4
pekat)
3. Diamati, jika menghasilkan warna hijau/hijau kebiruan
menandakan adanya karbohidrat.
Uji asam musat
Uji ini dilakukan untuk membedakan antara glukosa dan
galaktosa.
Prinsip dari uji asam musat adalah pencampuran larutan
sampel dengan HNO3 pekat kemudian dipanaskan.
Karbohidrat dengan asam nitrat pekat akan menghasilkan
asam yang dapat larut. Namun, laktosa dan galaktosa
menghasilkan asam musat yang dapat larut.
Cara kerja uji asam musat
1. 10 tetes larutan sampel dan 2 tetes HNO3 pekat
dimasukkan kedalam tabung reaksi
2. Dipanaskan dalam penangas air mendidih sampai
volumenya kira-kira tinggal 2-3 tetes
3. Didinginkan perlahan, diperhatikan terbentuknya
kristal keras seperti pasir
4. Diamati dibawah mikroskop
Analisis total gula metode anthrone
Prinsipnya adalah senyawa anthrone akan bereaksi secara
spesifik dengan karbohidrat dalam asam sulfat pekat
menghasilkan warna biru kehijauan yang khas. Senyawa
anthrone (9,10-dihidro-9-oxanthraccne) merupakan hasil
reduksi anthraquinone
Cara kerja metode anthrone
1. Pembuatan kurva standar
1. Pipet lar. Glukosa dengan berbagai volume, encerkan hingga
volume 1 mL
2. Buat lar blanko, pipet 1 mL air destilasi
3. Tambahkan pereaksi 5mL anthrone dengan cepat kedalam glukosa
standar blanko kemudian tutup. Dikocok hingga merata
4. Panaskan tabung reaksi pada penangas air mendidih selama 12
menit, dinginkan
5. Pindahkan larutan ke kuvet, baca absorbansi dnegan
spektrofotometer UV-Vis pada 630 nm
6. Buat plot kurva yaitu konsentrasi glukosa standar pada sumbe x
dan niali absorbandi pada sumbu y
2. Analisis sampel
1. sampel diencerkan
2. masukkan 1mL kedalam tabung reaksi tertutup
3. lakukan tahap seperti pada pembuatan kurva standar
•3.  Perhitungan
menentukan konsentrasi gula dalam sampel menggunakan kurva
standar dan memperhitungkan pengenceran yang dilkukannya

G: konsentrasi gula dari kurva standar


FP: faktor pengenceran
W: berat sampel
polarimeter
Pengujian
•  secara kuantitatif pada karbohidrat yang mampu memutar
bidang cahaya terpolarisasi dan memiliki sudaut putaran yang khas dan
berbeda beda.
Dilakukan dengan memasukkan larutan sampel dalam tabung polariskop
yang tertentu panjangnya, kemudian dilihat sudut putarannya

[α]20/D: sudut putaran spesifik pada 20C dan mengguankan D-line dari
sumber cahaya sinar natrium
a: sudut putar yang diamati
l: panjang gelombang polarimeter dalam desimeter
c: berat gula dalam gram per 100 mL larutan
POLArimeter
•Dapat
  juga digunakan pada campuran karbohidrat dengan
sudut putar yang berbeda. Misalnya untuk mengukue
banyaknya sukrosa yang telah terhidrolisis. Karena sudut
putaran khas sukrosa dan ekuimolar campuran diketahui,
maka prosentase sukrosa slat dihitung.

S: prosentase sukrosa
P: sudut putaran campuran
P1: sudut putar sesudah dihidrolisis
t: suhu
UJI xanthoprotein
Uji ini dilakukan untuk mengidentifikasi protein yang
memiliki gugus aromatik (benzen) contohnya sepertii
tyrosin, tryptopfan, dan fenilalanin.
Uji ini didasarkan pada proses nitrasi yang terjadi pada
cincin benzen oleh HNO3 yang membuat larutan protein
terdenaturasi. Hasil positif dari uji ini adalah timbulnya
warna kuning setelah dilakukan pemanasan dan
penambahan HNO3.
Cara kerja uji xanthoprotein
1. Larutan sampel dimasukkan kedalam tabung reaksi
2. Ditambahkan HNO3 dengan hati-hati
3. Dilakukan pemanasan pada penangas air
4. Perubahan warna diamati
5. Jika berubah menjadi berwarna kuning setelah
dipanaskan, sampel positif mengandung
tirosin/triptopfan/fenilalanin
UJI hopkins-cole
Uji ini dilakukan untuk mengidentifikasi asam amino
triptofan yang terdapat pada protein. Reagen hopkins-
cole adalah asam glioksilat yang memiliki gugus aldehid
dan asam karboksilat. Uji positifnya ditandai dengan
terbentuknya cincin ungu/violet.
Prinsip dari uji hopkins-cole ini adalah terjadinya
kondensasi protein dengan aldehid yang terdapat pada
asam glioksilat sehingga akan membentuk kompleks
berwarna bila terdapat asam kuat.
Cara kerja uji hopkins-cole
1. Larutan protein disimpan di tabung reaksi
2. Ditambahkan reagen hopkins-cole
3. Ditambahkan larutan asam pekat (H2SO4) melalui
dinding tabung
4. Tabung reaksi ditegakkan dan perubahan diamati
Uji millon
Uji ini dilakukan untuk menentukan asam amino tirosin
yang terdapat pada protein. Pereaksi millon ini terdiri dari
merkuro dan merkuri nitrast dalam asam nitrat.
Prinsip dari uji ini adalah pembentukkan garam merkuri
yang berwarna merah setelah dipanaskan. Reaksi ini
biasanya positif untuk fenol-fenol, karena terbentuknya
senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil yang
berwarna
Reaksi nitroprussida
Natriumnitroprusida dalam larutan amoniak mengasilkan
warna merah dengan protein yang memiliki gugus –SH
bebas. Jadi protein yang mengandung sistein dapat
memberikan hasil positif. Gugus –s-s- pada sistin apabila
direduksi terlebih dahulu dapat juga memberikan hasil
yang positif
Reaksi sakaguchi
Pereaksi yang digunakan adahal naftol dan
natriumhipobromit. Pada dasarnya reaksi ini memberi
hasil postif apabila terdapat gugus guanidin. Jadi arginin
atau protein yang mengandung agrimim dapat
menghasilkan warna merah
Metode kjeldahl
Metode ini dulakukan untuk menentukan jumlah protein secara empiris yang
umum dilakukan dengan menentukan jumlah nitrogen (N) yang dikandung
oleh suatu bahan. Metode ini dikembangkan oleh Kjeldah. Dalam penentuan
protein, seharusnya hanya nitrogen yang berasal dari protein saja yang
ditentukan. Akan tetapi hal tersebut sulit dilakukan karena kandungan
senyawa lain memiliki jumlah yang cenderung sedikit. Penentuan jumlah N
total ini dikatakan sebagai representasi jumlah protein yang akan dicari.
Kadar protein hasil dari analisis kadar protein metode Kjeldahl ini dengan
demikian sering disebut sebagai kadar protein kasar (crude protein).
Dasar perhitungan penentuan protein menurut Kjeldahl ini adalah hasil
penelitian dan pengamatan yang menyatakan bahwa umumnya protein
alamiah mengandung unsur N rata-rata 16% (dalam protein murni). Untuk
senyawa-senyawa protein tertentu yang telah diketahui kadar unsur N-nya,
maka angka yang lebih tepat dapat dipakai.
Apabila jumlah unsur N dalam bahan telah diketahui
(dengan berbagai cara) maka jumlah protein dapat
diperhitungkan dengan:

Jumlah N x 100/16 atau Jumlah N x 6,25

Untuk campuran senyawa-senyawa protein atau yang belum


diketahui komposisi unsur-unsur penyusunnya secara pasti,
maka faktor perkalian 6,25 inilah yang dipakai. Sedangkan
beberapa jenis protein telah diketahui faktor perkaliannya.
Tahapan metode kjeldahl
1. Proses destruksi
2. Proses destilasi
3. Proses titrasi
Metode lowry
Protein dengan asam fosfotungstat-fosfomolibdat pada suasana alkalis akan
memberikan warna biru yang intensitasnya bergantung pada konsentrasi protein
yang ditera. Konsentrasi protein diukur berdasarkan optical density (OD) pada
panjang gelombang 600 nm (OD terpilih). Untuk mengetahui banyaknya protein
dalam larutan, lebih dahulu dibuat kurva standar yang melukiskan hubungan
antara konsentrasi dengan OD. Biasanya digunakn protein standar Bovine Serum
Albumin (BSA) atau Albumin Serum Darah Sapi. Larutan Lowry ada dua macam
yaitu larutan A yang terdiri dari fosfotungstat-fosfomolibdat (1:1); dan larutan
Lowry B yang terdisi dari Na-karbonat 2% dalam NaOH 0,1 N, kupri sulfat dan Na-
K-tartrat 2%. Cara penentuannya adalah sebagai berikut: 1 ml larutan protein
ditambah 5 ml Lowry B, digojog dan dibiarkan selama 10 menit. Kemudian
ditambah 0,5 ml Lowry A digojog dan dibiarkan 20 menit, selanjutnya diamati OD-
nya pada panjang gelombang 600 nm. Cara Lowry 10-20 kali lebih sensitif daripada
cara UV atau cara Biuret.
Metode biuret
Larutan protein dibuat alkalis dengan NaOH kemudian ditambahkan larutan CuSO4 encer.
Uji ini untuk menunjukkan adanya senyawa-senyawa yang mengandung gugus amida
asam (-CONH2) yang berada bersama gugus amida asam yang lain atau gugus yang lain
seperti – CSNH2; – C(NH)NH2; – CH2NH2; – CRHNH2; – CHOHCH2NH2 – CHOHCH2NH2 –
CHNH2CH2OH; – CHNH2CHOH.
Dengan demikian uji biuret tidak hanya untuk protein tetapi zat lain seperti biuret atau
malonamida juga memberikan reaksi positif yaitu ditandai dengan timbulnya warna
merah-violet atau biru-violet.
Intensitas warna tergantung pada konsentrasi protein yang ditera. Penentuan protein
cara biuret adalah dengan mengukur OD pada panjang gelombang 560-580 nm. Agar
dapat dihitung banyaknya protein dalam bahan maka perlu lebih dahulu dibuat kurva
standar yang melukiskan hubungan antara konsentrasi protein dengan OD pada panjang
gelombang terpilih. Dibandingkan dengan cara Kjeldahl maka biuret lebih baik karena
hanya protein atau senyawa peptida yang bereaksi dengan biuret, kecuali urea.
Metode spektrofotometer uv
Reagen yang digunakan pada metode ini yaitu reagen
bradford. Kebanyakan protein mengabsorbsi sinar ultraviolet
maximum pada 280 nm. Hal ini tertutama oleh adanya asam
amino tirosin triptophan dan fenilalanin yang ada pada
protein tersebut. Pengukuran protein berdasarkan absorbsi
sinar UV adalah cepat, mudah dan  tidak merusak bahan.
Untuk keperluan perhitungan juga diperlukan kurva standar
yang melukiskan hubungan antara konsentrasi protein
dengan OD.
Metode turbidimetri/kekeruhan
Kekeruhan akan terbentuk dalam larutan yang mengandung
protein apabila ditambahkan bahan pengendap protein
misalnya Tri Chloro Acetic Acid (TCA), Kalium Ferri Cianida
K4Fe9(CN)6 atau asam sulfosalisilat. Tingkat kekeruhan diukur
dengan alat turbidimeter. Tabel atau kurva juga harus dibuat
terlebih dahulu untuk menunjukkan hubungan antara
kekeruhan dengan kadar protein (dapat ditentukan dengan
cara Kjeldahl). Cara ini hanya dapat dipakai untuk bahan
protein yang berupa larutan dan hasilnya biasanya kurang
tepat.
Metode pengecatan
Beberapa bahan pewarna misalnya Orange G, Orange 12 dan
Amido Black dapat membentuk senyawaan berwarna dengan
protein dan menjadi tidak larut. Dengan mengukur sisa bahan
pewarna yang tidak bereaksi dalam larutan (dengan
colorimeter), maka jumlah protein dapat ditentukan dengan
cepat. Tentunya tabel atau kurva standar perlu dibuat terlebih
dahulu untuk keperluan ini.

Anda mungkin juga menyukai