Anda di halaman 1dari 69

Program Studi SI Farmasi

STIKES Rumah Sakit Anwar Medika


ANALISIS SENYAWA AKTIF
DALAM SEDIAAN LIKUIDA
MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI
CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

Eviomitta Rizki Amanda, S.Si., M.Sc.


SEDIAAN FARMASI BENTUK
LIKUIDA
■ SIRUP
■ ELIKSIR
■ INJEKSI
■TETES
■ INFUS
BENTUK dan PEMAKAIAN
■Bentuk ■Pemakaian
■Larutan ■Peroral
■Suspensi ■Tetes mata
■Emulsi ■Tetes telinga
■Parentral
■Topikal
ANALISIS BAHAN AKTIF
DALAM SEDIAAN LIQUID DENGAN KCKT

■ SEDIAAN LIKUID ■KCKT


KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI/
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

• PERANAN DAN KEUNGGULAN


1 • PRINSIP PEMISAHAN

• KROMATOGRAM DAN RESOLUSI


2 • INSTRUMENTASI
• APLIKASI : ANALISIS KUALITATIF
• APLIKASI : ANALISIS
3 KUANTITATIF
PERANAN KCKT

Tidak kurang dari 145


bahan baku dan/atau
sediaan farmasi yang
menggunakan KCKT
untuk identifikasi dan
penetapan kadar
KEUNGGULAN KCKT

■Penggunaannya luas

■Sesitivitas dan selektifitas baik

■Akurasi dan presisi baik

■Dapat untuk analisis senyawa non volatile

■Dapat untuk analisis senyawa termolabile


MEKANISME PEMISAHAN KCKT

• FENOMENA INTERAKSI
ADSORB ANALIT DENGAN
SI PERMUKAAN PARTIKEL
PADAT FASE DIAM (S)

• PERBEDAAN
KELARUTAN ANALIT
PARTISI DALAM DUA MACAM
FASE CAIR YANG TAK
SALING CAMPUR
(IMISCIBLE) DALAM
FASE DIAM (S)
MEKANISME PEMISAHAN KCKT

• FENOMENA PERTUKARAN
ION ANTAR ANALIT DAN
ION FASE DIAM /RESIN
EXCHANGE PENUKAR ION : ANION
ATAU KATION

PERMEA • PERBEDAAN UKURAN


MOLEKUL/ BERAT MOLEKUL
SI ANTAR ANALIT
KOMPARASI
HPLC GC
■ Suhu kamar, dapat ■ Suhu tinggi, tidak
untuk analit yang dapat untuk analit
termolabile yang termolabile,
■ Fase gerak dapat ■ Fase gerak
bervariasi,
terbatas,
sehingga melalui
optimasi
pemakaian
pemakaian sangat terbatas, tetapi
luas tapi relatif relatif sangat
mahal murah
PRINSIP PEMISAHAN KCKT
UPIN DAN IPIN NONTON PAMERAN LUKISAN

S S S S S S S S

S S S S S S S
S

Tidak suka lukisan, maka keluar duluan


(Cs <, Kd<, tR <)

Kd = Cs/Cm Suka lukisan maka keluar belakangan.


(Cs>, Kd >, tR >)
Besaran Kromatogram
Waktu retensi (tr)

tY
Respo Luas Puncak/Peak
ns Area (A)
Detekt tX
or
Tinggipuncak/peak
tM
height (h)

Wakt
u
Lebar puncak/peak
width (w)
Kemungkinan Rs
EFESINS SELEKTIFI KAPASITA
I TAS S
A KURAN KURANG KURANG
A G
B BAIK KURANG CUKUP
B
C KURAN BAIK CUKUP
G
C
D BAIK BAIK BAIK
D
INSTRUMENT KCKT
SKEMA INSTRUMENT KCKT
KOMPONEN UTAMA KCKT

POMP
A

DETEK
TOR INJEK TOR

KOM
PONEN

KOLO ELUEN
M
POMPA

■ Mengalirkan eluen kedalam injektor, kolom dan detektor


dengan tekanan tinggi
■ Dapat diprogram untuk mengatur kecepatan dan
komposisinya (isokratik atau gradient).
■ Terbuat dari bahan yang inert, tidak korosif dan reaktif
terhadap eluen atau analit
INJEKTOR

■Aliran henti : waktu menyuntikkan sampel


fase gerak dihentikan dulu, sehingga pada
kondisi tekanan atmosfer
■ Menggunakan septum, waktu penyuntikan
sampel fase gerak tetap berjalan pada
tekanan 60-70 atmosfer
MEKANISME : POMPA-INJEKTOR-KOLOM
KOLOM REVERSE-PHASE
(RP)
■ ADA KOLOM ANALISIS DAN KOLOM PREPARATIF,
■ KOLOM ANALISIS : DIAMETER=2-6mm, PANJANG 10-30 cm,
DIGUNAKAN UNTUK ANALISIS KUALITATIF DAN KUANTITATIF
■ KOLOM PREPARATIF : DIAMETER 6mm, PANJANG 25-100
cm, DIGUNAKAN UNTUK ISOLASI BAHAN AKTIF ATAU
PEMISAHAN ANALIT DALAM CAMPURAN
■ ADA NORMAL PHASE (NP) DAN REVERSE PHASE (RP)
JENIS KOLOM RP

NAMA JUMLAH TYPE DAN


C UKURAN
HIPERSIL/SAS C-1 NP-SPHERICAL
SPHERISORB/S5P PHENYL NP-SPERICAL
LICHROSORB/RP-18 C-18 NP-SPHERICAL
NOVA-PAK/C-18 C-18 NP-SPHERICAL
NUCLEOSIL/C-18 C-18 NP-SPHERICAL
PARTISIL/10-SAX SULFON IRREGULAR
AT
LICHROSORB-CN/RP- CH3-CN IRREGULAR
CN
KOMPARASI
KARAKTERISTIK FASE NORMAL FASE BALIK
(NP) (RP)
Polaritas fase solid Tinggi Rendah
Polaritas fase Rendah-medium Medium tinggi
mobile
Urutan elusi Makin non polar Makin polar
lebih dulu lebih dulu
Tipe fase mobile Heptane/CHCl3 Metanol/air
Retensi makin Polaritas fase Polaritas fase
tinggi jika mobile makin kecil mobile makin
tinggi
Hubungan Polaritas - tr

2 3
1

4 5
Hubungan Polaritas Analit - tr
Urutkan waktu retensi (tr)....?

1 2

4
3
Urutkan waktu retensi (tr)....?

1 3
2

5 6
4
Urutkan waktu retensi (tr)....?

2
1 3

5 6
4
ELUEN/FASE GERAK

Syarat :
■ Murni,
■ Inert ( tidak merusak kolom dan analit),
■ Sesuai detektor yang dipakai
■ Melarutkan seluruh analit,
■ Viskositas rendah,
■ Memungkinkan mengisolasi kembali analit
■ Relatif murah
MACAM DETEKTOR

■ UV-detector
■ Flourescense-detector
■ Electrochemical-detector
■ Refractive-detector
■ Multipurpose-detector
■ Ftir-detector
■ Mass-spectra-detector
SYARAT DETEKTOR

■ Sensitif
■ Linier
■ Universal
■ Respon dapat diprediksi
■ Stabil, tidak terpengaruh oleh perubahan
kondisi
■ Non-destruktif
■ Murah/biaya opersaional rendah
TAHAPAN ANALISIS KCKT

PREPARASI SAMPEL
ISOLASI CLEAN UP

PENYIAPAN KONSISI KCKT


FASE
KOLOM DETEKTOR
GERAK/ELUEN

LARUTAN BAKU
BAKU EKSTERNAL BAKU INTERNAL
Kondisi KCKT
■Mengacu pada:
- Farmakope
- literatur (journal, buku, dsb)
- hasil penelitian yang pernah dilakukan
■ Apabila belum ada harus menentukan sendiri
dengan melakukan studi optmasi
■ Optimasi : pemilihan kolom dan fase gerak
(Segitiga Snyder atau Window Diagram)
Prinsip Pemilihan Kolom

Eluen non
Fase polar
normal
Analit polar
Kolom
Eluen polar
Fase
balik Analit non
polar
Contoh : Analit polar
■Campuran kalium sulfoguayakolat,
dekstrometorfan-HCl, difenhidramin-HCl
■Ditambahkan ion-pair : dietilamine atau
heksan sulfonat
■Polaritas akan menurun mendekati non-polar,
sehingga dapat digunakan kolom fase balik
■Kolom fase balik (non-polar) : lichrosorb CN
■Fase gerak/eluen: Metanol-dietilamine pH 5
atau metanol-heksan sulfonat pH 5.
Ion –Pair : Adrenalin injeksi

ADRENALI
N
SOSA (sodium
octanesulfonic
acid

KOLO
M ODS
Ion-Pair :
Ascorbic Acid Injection/Syrup

ASCORBIC
ACID

CETRIMID (AMONIUM
KUARTERNER)

KOLOM
ODS
2. Pemilihan detektor

■Dasar : struktur komponen dari analit

■Ditentukan detektor spektrofotometer,


maka:

- Tentukan ‫ ג‬analisis, dimana a(serapan)


masing2 komponen analit cukup besar

- Tentukan dulu ‫ ג‬maksimum masing2


Derivatisasi
■Meningkatkan respon detektor
■Meningkatkan Rs dan α
■Meningkatkan efektivitas proses
ekstraksi dan clean up analit
■Membedakan respon detektor relatif
antara dua analit yang berbeda
■Dapat dilakukan pra-kolom dan
pasca-kolom
Derivator pra-kolom
Derivator Gugus fungsi analit
Bromofenasil Asam karboksilat
Benzoill khlorida Alkohol
Nitrobenzioil khlorida Amina
Dinitrofenilhidrazin Aldehid / keton
Dansil khlorida Peptida
Piridoksal Asam amino / amina
Derivator pasca-kolom
Derivator Gugus fungsi analit
O-nitrofenol Asam karboksilat
Ninhidrin Amina
Difenil hidrazin Aldehid / keton
Floresamina Peptida

Floresamina Asam amino / amina


Derivatisasi Neomycin (tetes
mata)
NEOMYCIN (TIDAK
ADA GUGUS
CHROMOPHOR)
FLURODINITROBEN
ZEN (DIBERI
GUGUS KROMOFOR
(R)
DERIVAT
NEOMYCIN
DENGAN GUGUS
KHROMOFOR
SEKALIGUS
MENURUNKAN
POLARITAS
ANALISIS
KUANTITATIF
MENGGUNAKAN HPLC
Aplikasi : Analisa Kuantitatif

■ Prinsip : Tinggi/luas puncak kromatogram


berbanding linier dengan konsentrasi
solut/sampel
■ Ada 3 (tiga) macam:
 Metode standar eksternal,
 Metode standar internal,
 Metode standar adisi (Spike)
Metode Standar Eksternal

Multilevel / Multipoint Calibration


■Buat kurva kalibrasi zat standar antara area
puncak vs konsentrasi satu seri larutan standar
(5-6) macam kadar yang mendekati kadar
sampel,
Diuji linieritas, r>0,999
 Kadar dihitung berdasarkan persamaan
regresi linier y=bx + a (y=peak area,
x=konsentrasi analit, b=respon factor,
a=konstanta/respon noise)
Persamaan dan garis regresi

PA y = bx +
a

Konsentrasi
analit

Pada KCKT ada yang dilengkapi dengan komputer


yang dapat langsung menghitung kadar zat
dalam sampel
Metode Standar Eksternal

Single point calibration/standart/Metode


Perbandingan Konsentrasi
■ Dibuat satu macam kadar standar yang mendekati
kadar analit dalam sampel (Cst)
■ Larutan standar dan larutan sampel diinjeksikan
dengan volume penyuntikan dan kondisi KCKT yang
sama
■ Dari data peak area analit dalam sampel (Pax) dan
analit standar (PAst) dapat dihitung kadar analit
dalam sampel (Cx) dengan rumus :
■ Cx=(PA x:PA st)xCst
Tiap satu sendok pakai (5ml)
eliksir mengandung 30 mg
pseudoephedrine, 1,25mg
tripolidine hidrochloride,
10mg dextrometorphan
hidrobromide

Mengandung Pemanis non


gula, Pewarna dan
Pengawet, sehingga tidak
kental (dapat dipipet)
Setiap komponen mempunyai ƌ maksimum
dan kadar yang berbeda, maka jika digunakan detektor UV
harus dipilih ƌ yang tepat (memberikan serapan cukup
tinggi) maka sebaiknya menggunakan DAD
Dipipet tepat 5,0 ml sirupsampel
kedalam corong pisah, tambahkan 1ml
amonia 10 M (suasana basa) disari 2x
dengan masing-masing 10ml
khloroform. Lapisan khloroform
dikumpulkan dan diuapkan di evaporator
samapai kering. Residu dilarutkan
dengan 10ml methanol dan dipindahkan
ke labu ukur 100ml kemudian encerkan
dengan fase diam yang digunakan
sampai garis tanda.

Dibuat baku yang mengandung


pseudoephedrine, tripolidine hidrochloride, dan
dextrometorphan hidrobromide dengan
perbandingan dan kadar yang setara dengan
yang ada dalam sampel
Kolom yang digunakan adalah
kolom ODS 25cmx4,6mm,
dengan fase gerak
asetonitril/buferfosfat 0,05M pH
6,8 (35:65), 1ml/menit, detektor
DAD pada 260nm)
Sampel dan standar disuntikkan
ke KCKT dengan volume
penyuntikan dan kondisi yang
sama, kemudia kromatogram
yang dihasilkan direkam data-
datanya. Berdasarkan data yang
diperoleh dilakukan penghitungan
kadar analit dalam sampel
menggunakan data larutan
standar
Kromatogram
Data kadar dan peak area
Perhitungan kadar : single
point
■Kadar pseudoefedrine (Cp)
Cp=(318.915:325.178)x31,23=30,63mg/100
ml
■Residu dari 5ml eliksir sampel diencerkan
sampai 100ml
■Setiap 5ml sampel eliksir mengandung 30mg
pseudoefedrine, maka % recovery =
(30,63:30)x100%=102,10%
Hitung kadar komponen yang
lain!!!.....
2. Metode Standar Internal

■ Keuntungan : mengurangi kesalahan-


kesalahan pada ekstraksi, penyuntikan
secara manual,
■ Cara:
- Zat standar dan sampel ditambahkan
sejumlah tertentu standar internal
- buat kurva kalibrasi antara rasio
area/tinggi puncak zat standar terhadap
area/tinggi puncak standar internal vs
konsentrasi
Syarat standar internal
■Mempunyai sifat fisika dan kimia sama atau
hampir sama dengan zat yang akan
ditentukan
■Mempunyai respon faktor hampir sama
dengan analit yang akan ditentukan,
■Harga Rs cukup baik > 1,5
■Zat tersebut tidak boleh ada di dalam sampel
■Zat tersebut harus murni dan stabil dalam
penyimpanan.
Metode Standar Internal..1

Multilevel / Multipoint Calibration


a. Membuat kurva baku
■Buat satu seri (5-6) konsentrasi standar analit
bervariasi kemudian ditambah dengan standar
internal pada konsentrasi yang tetap.
■Dibuat kurva kalibrasi melalui persamaan regresi
y=bx+a, dimana y=rasio PAzat standar/PA zat
internal standar, x=kadar zat standar.
Diuji linieritas, r>0,999
Persamaan dan garis regresi

PAst
y = bx +
PAst.i a

Kons. Stand.
Metode Standar Internal..1 (cont.)

b. Membuat larutan sampel


(Analisis Sampel)
■Larutan sampel ditambah dengan
larutan internal standar, kemudian
disuntikkan ke KCKT dengan volume
dan kondisi yang sama dengan
standar dan akan diperoleh data PA
standar dan PA internal standar
■Kadar analit dalam sampel (Cx)
dihitung berdasarkan persamaan
Contoh aplikasi : Miconazole tetes
telinga

Penetapan kadar miconazole dengan


standar internal econazole
Data konsentrasi standar dan PA

1. Hitunglah persamaan regresi dan harga r


2. Hitunglah konsetrasi miconazole dalam larutan
sampel , jika diketahui PA miconazole=119.923, dan
PA econazole = 124.118
Metode Standar Internal..2

Single-level / One-point Calibration


a. Membuat larutan standar
■Buat satu konsentrasi standar analit (Cst) yang
mendekati kadar analit dalam sampel kemudian
ditambah dengan satu macam konsentrasi standar
internal.
■Larutan campuran tersebut disuntikkan ke dalam KCKT
dengan kolom, fase gerak dan pada kondisi tertentu
akan menghasilkan data PA standar dan PA internal
standar.
Metode Standar Internal..2
b. Membuat larutan sampel
■Larutan sampel hasil isolasi dari sediaan
ditambah dengan larutan internal
standar, kemudian disuntikkan ke KCKT
dengan volume dan kondisi yang sama
dengan standar dan akan diperoleh data
PA standar dan PA internal standar
■Kadar analit dalam larutan sampel (Cx)
dihitung berdasarkan rumus:
Contoh : Penetapan Kadar
Hidrokortison
■ Penetapan kadar hidrokortison dengan standar internal
betamethazon
■ Data kromatogram adalah sebagai berikut :

Analit Kadar Peak Area Peak Area


(ppm)
Hidrokortis 10 ppm 345.210 -
on
Betametas 5 ppm - 245.055
on
Hitunglah kadar hidrokortison dalam larutan
Campuran ?? 380.545 288.905
sampel
Kromatogram

Standar +
internal
standar
Sampel +
internal
standar
3. Metode Standar Adisi/Spike

■Digunakan pada analisis kadar sampel


yang relatif kecil
■ Misal : - Kadar obat/metabolitnya dalam
cairan biologis
- Analisis runut (trace analysis)
-Analisa Residu
Luas area sampel (Px) = Luas area saampel spike – luas
area std.
Konsentrasi sampel spike (Cx)= Px/Pstd * Cstd
Lanjutan..
■ Cara :
- Sampel ditambahkan zat yang sama
(standar) dengan zat yang akan
ditentukan
- Buat minimal 4 konsentrasi yang
berbeda sehingga didapat kurva linier
hubungan antara kadar zat yang akan
ditambahakan dan area/tinggi puncak
kromatogram
Lanjutan..

Luas
area/tinggi
puncak y = ax +
b

c2
c4
c1
c3

Kadar penambahan zat


Lanjutan..
Luas area/tinggi
puncak

x=0 y = ax +
y=b b

(Tanpa ada
penambahan c2
) c4
c1
c3

Kadar penambahan zat


0
b
y=0 x= -
a
(Kadar sampel)
■ Ekstrapolasi kekiri Area/tinggi
puncak
memotong sumbu y
didapat harga b
(area/tingi puncak b
tanpa penambahan Y = aX
zat).
■ Jadi b=area/tinggi
sampel 0 b/a

■ Harga -b/a adalah


kadar terukur dari
sampel