ENZIM RESTRIKSI PENGKLONAN

DARI DNA REKOMBINAN

Disusun oleh :
1. E. Elda Ernawati
2. Rista ristiawati
3. Anisa
4. Rifki setiaprayoga
5. Andika permana
 Enzim Restriksi
Enzim restriksi adalah Enzim yang dapat
mengkatalisasi pembelahan / pe motongan DNA
dibeberapa tempat / lokasi spesifik dengan jumlah yang
terbatas & dapat direproduksi. Enzim ini disebut juga
dengan nama endonuklease restriksi ( Russell, 1980).
Semua enzim ini mampu memecah ikatan fosfodiester
asam nukleat umumnya berupa tangga, karena urutan
target umumnya sering muncul berkali kali.
fragmen enzim restriksi berupa DNA untai ganda
dengan sedikitnya satu ujung untai tunggal.
 Sejarah penemuan enzim restriksi

Stewart Linn & Werner Arber (1960)

Menemukan : Enzim modifikasi maupun enzim nuklease “restriksi”
dalam bakteri E.coli galur B yang dapat menguraikan DNA yang
tidak termetilkan.
Hamilton Smith (1970)
Pertama kali menemukan enzim nuklease restriksi spesifik yang
memutus DNA pada tempat- tempat tertentu dan dapat
diidentifikasikan, dari Haemophilus influenzae yang dikenal dengan
nama HindII,
Watson dkk, (1983)
Menemukan nuklease restriksi & metilase modifikasi dalam dua
galur E.coli lain yang membuka kemungkinan adanya banyak
nuklease yang spesifik untuk suatu tempat.
Gambar Pemotongan molekul DNA dengan enzim restriksi
endonuklease tipe I, II, dan III
Gambar 2. Hasil pemotongan molekul DNA dengan enzim restriksi
endonuklease berbeda. (A) ujung blunt dan ujung sticky. (B) Tipe ujung
sticky berbeda. (C) Tipe ujung sticky sama dihasilkan oleh dua enzim
restriksi endonuklease berbeda.
Gbr. Pemisahan DNA oleh enzim restriksi
 
Teknologi DNA Rekombinan
 
Teknologi DNA Rekombinan atau sering disebut juga rekayasa
genetika adalah suatu ilmu yang mempelajari mengenai
pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan
cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga
memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami
perbanyakan dalam suatu sel organisme lain yang berperan
sebagai sel inang.
 Manfaat rekayasa genetika ini adalah mengisolasi dan
mempelajari masing-masing gen tentang fungsi dan
mekanisme kontrolnya.
Selain itu, rekayasa genetika juga memungkinkan diperolehnya
suatu produk dengan sifat tertentu dalam waktu lebih cepat
dan jumlah lebih besar daripada produksi secara konvensional.
Ada beberapa bagian terpenting yang selalu
digunakan dalam rekayasa genetika.Yang pertama
adalah enzim seluler dan yang kedua adalah vektor.
 Kloning
Kloning Dari Bahasa Yunani yaitu- klon yang berarti
tunas muda. Kumpulan turunan suatu individu yang
dihasilkan tanpa melalui perkawinan; kumpulan
replika sebagian atau seluruh makromolekul (contoh,
DNA atau antibodi).
Suatu individu yang tumbuh dari satu sel somatik
induknya serta memiliki identitas genetik yang sama
dengan induknya.
Klon: Koleksi molekul atau sel yang semua
identitasnya sama dengan molekul atau sel
penurunnya
Tujuan mengklon Gen
Menentukan urutan basa nukleotida penyusun gen
tersebut
Menganalisis atau mengidentifikasi urutan basa
nukleotida pengendali gen tersebut
Mempelajari fungsi RNA / protein/enzim yang disandi
gen tersebut
Mengidentifikasi mutasi yang terjadi pada kecacatan
gen yang mengakibatkan penyakit bawaan.
Merekayasa organisme untuk tujuan tertentu, misalnya
memproduksi insulin, ketahanan terhadap hama, dll.
Langkah-Langkah Kloning
Menyiapkan DNA yang akan di’klon’
Memotong DNA yang akan di’klon’ dan plasmid
pembawa menggunakan enzim yang sama
Menyambung DNA yang akan di’klon’ dan plasmid
pembawa (Ligasi)
Pemindahan DNA ke dalam sel inang (Transformasi)
Penumbuhan sel inang
Vektor untuk Mengklon

Vektor berupa plasmid

Vektor berupa bakteriofaga
Cosmid
BACs (Bacterial Artificial Chromosome)
Bahan/Alat untuk Meng’klon’
Enzim endonuklease restriksi
Enzim ligase
Vektors
Inang (Host)
Metoda untuk memasukkan DNA ke dalam sel inang
Tahapan-tahapan dalam mengkloning suatu gen adalah sebagai berikut
:

Suatu fragmen DNA yang mengandung gen yang akan

dikloning pertama-tama diinsersikan dulu pada molekul
DNA sirkular yang disebut vector untuk menghasilkan
molekul DNA rekombinan atau chimoera.
Vektor kemudian bertindak sebagai pembawa DNA
rekombinan tersebut untuk masuk ke dalam host
biasanya berupa bakteri, maupun sel-sel jenis lainnya
yang bisa digunakan.
Kemudian vektor mengadakan replikasi dalam sel host
yang  menghasilkan banyak turunan-turunan identik,
baik vektornya sendiri, maupun gen yang dia bawa.
Ketika sel host membelah, salinan molekul DNA
rekombinan diwariskan pada progenya dan terjadi
replikasi vektro selanjutnya.
 Setelah terjadi sejumlah besar pembelahan sel, maka
dihasilkan koloni atau sel kloningan yang identik.
Tiap-tiap sel dalam klon mengandung satu atau lebih
kopian molekul DNA rekombinasi.
Dengan demikian, dapat dikatakan bahwa, gen yang
dibawa oleh molekul rekombinasi telah diklon.