TEKNIK ISOLASI, PEMURNIAN

DAN ANALISIS RNA

ANDI NUR IFAH DEWI AM

H31114501

DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2018
 PENDAHULUAN

RNA Polinukleotida Nukleotida

Menurut Sambrook dan Basa nitrogen

Russel (2001), sel mamalia Gula pentosa
mengandung RNA sebesar Gugus Fosfat
10-5 μg, 80% - 85% dari
total RNA
Seperti halnya DNA, RNA
dapat diisolasi dengan
menggunakan beberapa
metode sesuai dengan
tujuan isolasi, pemurnian
dan analisisnya
RUMUSAN MASALAH
 bagaimanakah struktur RNA?
 bagaimana teknik isolasi, pemurnian dan
analisis RNA ?
TUJUAN PENULISAN
 untuk mengetahui struktur RNA?
 untuk mengetahui teknik isolasi, pemurnian
dan analisis rna ?
RNA
Gen pada semua organisme prokariot dan
eukariot terbuat dari DNA. Pada virus gen
terbuat dari DNA atau RNA (asam ribonukleat).
RNA, seperti halnya DNA, merupakan polimer
panjang tidak bercabang yang terdiri dari
nukleotidanukleotida yang bersambung dengan
ikatan 3'  5' fosfodiester
STRUKTUR RNA
Struktur kovalen RNA
berbeda dengan DNA
dalam dua hal :
1. unit - unit gula dalam
RNA berupa ribosa
bukan deoksiribosa
2. satu dari keempat basa
utama dalam RNA
adalah urasil (U) yang
menggantikan timin
(T).
DUA KELOMPOK RNA YANG
MENYUSUN MAHLUK HIDUP
1. RNA genetik memiliki fungsi yang sama
dengan DNA, yakni merupakan molekul
genetik yang secara keseluruhan
bertanggung jawab dalam membawa segala
materi genetis, seperti yang dimiliki oleh
DNA.
2. RNA nongenetik merupakan RNA yang tidak
berperan sebagai DNA. RNA nongenetik
dimiliki oleh makhluk hidup yang materi
genetiknya diatur oleh DNA.
LANJUTAN….

RNA RNA
RNA duta 1 nongenetik 2 transfer
(mRNA)
(tRNA)

RNA
ribosom
(rRNA)
TUJUAN DAN ISOLASI RNA
 Isolasi adalah prosedur yang digunakan unutk
memisahkan suatu bagian dari bagian lain
dengan tujuan tertentu.
 Tujuan isolasi RNA digunakan untuk
memisahkan RNA dari zat lain sehingga
dihasilkan RNA murni.
 Prinsip isolasi RNA sebenarnya tidak jauh
berbeda dengan isolasi DNA.
PRINSIP ISOLASI RNA
1.Ekstraksi RNA

Metode untuk ekstraksi RNA mirip dengan metode ekstraksi DNA.

Namun, molekul RNA relatif lebih pendek dan lebih sulit rusak
dengan pemotongan sehingga disrupsi sel dapat dilakukan dengan
lebih agresif. Meskipun demikian, RNA sangat mudah dihancurkan
oleh RNase yang terdapat endogen dengan konsentrasi yang
bervariasi di dalam sel dan di eksogen di jari tangan. Sehingga,
untuk ekstraksi RNA harus menggunakan sarung tangan dan
medium yang digunakan untuk isolasi harus mengandung
detergen kuat untuk segera mendenaturasi RNase yang ada.
2. Presipitasi RNA
Untuk melihat RNA yang sering tidak terlihat
sebelum sentrifugasi tetapi banyak bentuk
yang berhubugan gen di bagian bawah tube.

3. Pemurnian RNA
Tingkat kemurnian RNA berbanding lurus
dengan nilai absorbansi dan berkolerasi positif,
apabila nilai rasio absorbansi sama dengan 2,
maka sampel tidak terkontaminasi pada
pengukuran spektrofotometer UV.
TAHAPAN IDENTIFIKASI
MOLEKULAR SUATU GEN
METODE ISOLASI RNA
1. Metode Guanidin Tiosianat

Prinsip kerja : melisiskan membran sel dan

membuat RNA larut di dalam larutan yang
mengandung guanidin tiosianat.
Penambahan larutan fenol/ kloroform pada
larutan guanidin tiosianat dapat membuat
pH larutan menjadi asam (pH 4). Di bawah
kondisi asam, protein dan fragmen DNA (50
bp - 10.000 bp) akan berada pada fase
interfase, sedangkan RNA berada pada fase
cair
2. Metode modifikasi Guanidin Tiosianat

Prinsip kerja : modifikasi dari purifikasi RNA

metode guanidium tiosianat. Isolasi RNA
menggunakan prosedur ini membutuhkan
waktu selama 4 jam dan memberikan hasil
dengan tingkat kemurnian yang tinggi.
3. Metode Kromatografi Selulosa Oligo-deoxythymine (DT)

Dengan metode ini RNA Poli (A)+ dapat diisolasi dari RNA

total menggunakan seleksi selulosa oligo (dT) ata u langsung

dari sampel jaringan dan kultur sel. Purifikasi mRNA dari RNA

total direkomendasikan untuk jaringan dan sel yang

bersumber dari bagian yang kaya RNase, sebagai upaya untuk

meminimalisir kemungkinkan degradasi RNA selama proses

ekstraksi
4. Metode Trizol ( Modifikasi Guanidin tiosianat)
Metode Trizol merupakan salah satu modifikasi
lainnya dari Guanidin tiosianat.

5. Metode Langsung Isolasi RNA menggunakan

Reagen kit

Saat ini metode langsung untuk teknik isolasi pada

analisis biologi molekuler menggunakan reagen kit
sudah banyak diproduksi. Di antaranya yaitu protokol
ekstraksi RNA virus yang diproduksi oleh Qiagen.
TEKNIK ISOLASI DARI MESOKARP
KELAPA SAWIT (E. GUINEENSIS)
Mesokarp Kelapa sawit

- Ditimbang sebanyak 50 – 100 mg

- Dipotong kecil-kecil dengan ukuran(± 2 cm x 3 cm)
- Dipindahkan ke mortat yang sudah disiram dengan
nitrogen cair
- Potongan jaringan digerus dan dengan sekali-kali
disiram nitrogen cair sampai menjadi bubuk halus.
Bubuk
Sampel
Bubuk sampel

- Dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifugasi 1,5 mL

bebas-RNase yang telah didinginkan dengan nitrogen
cair yang berisi 450 μL buffer lisis (RLT, RLC) dan 5 μL
β- merkaptoetanol ditambahkan ke dalam tabung
mikrosentrifugasi.
- Lisat dipindahkan ke dalam spincolumn QIAshredder
(warna ungu) yang sudah dipasang pada tabung koleksi 2
mL dan disentrifugasi (13.000 rpm; 25°C) selama 2
menit.
- Supernatan dipindahkan ke dalam tabung
mikrosentrifugasi 1,5 mL yang baru. Sebanyak 250 μL
EtOH absolut ditambahkan.
- Campuran dihomogenkan dengan pipetting (up-down).
- Tabung diinkubasi selama 1-2 menit pada 37°C.
- Campuran dipindahkan ke dalam spin-column Rneasy (warna
merah muda) yang sudah dipasang pada tabung koleksi 1,5 mL
dan disentrifugasi (13.000 rpm; 25°C) selama 1 menit.
- Cairan yang berada di tabung koleksi dibuang. Spin-column
dipasang kembali pada tabung koleksi. Sebanyak 700 μL
buffer RW1 ditambahkan ke dalam spin-column RNeasy dan
campuran disentrifugasi (13.000 rpm; 25°C) selama 1 menit.
- Cairan yang berada di tabung koleksi dibuang dan spin-column
dipasang kembali pada tabung koleksi.
- Sebanyak 500 μL buffer RPE ditambahkan ke dalam membran
spin-column RNeasy dan disentrifugasi (13.000 rpm; 25°C)
selama 1 menit
- Cairan yang berada di tabung koleksi dibuang dan spincolumn
dipasang kembali pada tabung koleksi.
- Sebanyak 500 μL buffer RPE ditambahkan ke dalam spin-
column RNeasy dan campuran disentrifugasi (13.000 rpm;
25°C) selama 2 menit.
- Cairan yang berada di tabung koleksi dibuang dan spin-column
dipasang ke dalam tabung koleksi 2 mL yang baru.
- Sebanyak 30-50 μL air bebas RNase atau air yang sudah diberi
DEPC ditambahkan ke filter membran spin-column dan
disentrifugasi (13.000 rpm; 25°C) selama 1 menit. Spin-
column RNeasy dibuang dan tabung koleksi disimpan pada
suhu -80°C. Kualitas dan kuantitas hasil isolasi RNA
diperkirakan melalui elektroforesis gel agarosa 1% dan
pengukuran absorbansi.
Hasil
ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA
Agarosa
- Konsentrasi agarosa 1% digunakan untuk memeriksa hasil isolasi RNA.
- Dipadatkan menjadi gel, sisir dilepaskan dari cetakan dan dipasang pada
bak elektroforesis.
- Buffer TAE 1× digunakan untuk merendam gel dalam bak elektrofores is.
- Loading mixture disiapkan dengan mencampurkan loading dye 6× dengan 4
μL isolat RNA di atas kertas parafilm. Loading mixture dimasukkan ke
dalam masing-masing petak sumur.
- Sebanyak 3 μL marker DNA ladder (1 kb) juga dimasukkan ke dalam petak
sumur.
- Bak elektroforesis ditutup dengan mengatur bagian kutub negatif pada
kepala sumur.
- Mesin elektroforesis dinyalakan. Besar tegangan dan waktu operasi yang
digunakan pada penelitian bervariasi antara 80-100 V selama 30-50 menit.
- Setelah selesai, mesin dimatikan dan gel dikeluarkan. Gel diamati di UV
transilluminator dalam ruang gelap. Dokumentasi dilakukan dengan
kamera yang dihubungkan dengan perangkat komputer. Sinar UV
memendarkan pita DNA sehingga dapat ditangkap kamera dan dilihat
melalui monitor komputer. Foto visualisasi gel disimpan dalam hard-disk
komputer.

Hasil
HASIL ISOLASI MESOKARP
KELAPA SAWIT
PURIFIKASI DENGAN DNASE
RNASE FREE THERMO SCIENTIFIC KITS

Tahap purifikasi RNA melalui resuspensi

antara RNA (1 μg/μL) dengan DNAse RNAse

free Thermo Scientific Kits dengan

menggunakan metode Wiame (2000) dan

Zilienskiene (2012).
HASIL PENGUKURAN KONSENTRASI
DAN KEMURNIAN RNA TOTAL
KESIMPULAN
1. Struktur kovalen RNA berbeda dengan DNA
dalam dua hal yaitu 1) unit - unit gula dalam
RNA berupa ribosa bukan deoksiribosa. Ribosa
mengandung sebuah gugus 2' -hidroksil yang
tidak terdapat deoksiribosa. 2) keempat basa
utama dalam RNA adalah urasil (U) yang
menggantikan timin (T). Urasil, seperti timin,
dapat membentuk pasangan basa dengan
adenin, tetapi tidak mengandung gugus metil
yang terdapat dalam timin.
2. a.Teknik Isolasi RNA dapat terbagi sebagai berikut:
 Metode Guanidin Tiosianat
 Metode modifikasi Guanidin Tiosianat
 Metode Kromatografi Selulosa Oligo-deoxythymine (DT)
 Metode Trizol ( Modifikasi Guanidin tiosianat)
 Metode Langsung Isolasi RNA menggunakan Reagen kit
b. Upaya purifikasi RNA merupakan tahapan penting menjaga
kemurnian RNA terhadap kontaminasi RNAse. Ribonuklease (RNAse)
merupakan enzim yang dapat mendegradasi RNA. Purifikasi RNA
diperlukan karena struktur kimia RNA lebih rentan terhadap
kontaminasi RNAse dari lingkungan, jika dibandingkan dengan DNA.