ISOLASI DNA

DNA pada prinsipnya dapat diisolasi dari berbagai sumber,

anatara lain darah, organ tubuh, daging, serangga, daun dan
sebagainya. Pada individu yang sama, DNA yang diperoleh dari
berbagai sumber, akan memiliki jenis, jumlah dan ukuran yang
sama. Untuk memperoleh isolat DNA dari sampel, ada beberapa
hal yang perlu diperhatikan yaitu :
1.      Pemecahan dinding sel dan membran inti , dapat
dilakukan dengan 2 cara :
a.       Secara fisik, yaitu pemecahan sel dengan cara resonansi
atau kekuatan mekanik
b.      Secara kimia, yaitu dengan cara buffer lisis yang dapat
merusak integritas barier dinding dan membran sel, contohnya
lisosim, EDTA, Tris-Hcl, SDS
2.      Pemisahan larutan DNA dari debris dengan
cara centrifuge
3.      Presipitasi RNA dan protein agar
diperoleh DNA yang murni menggunakan
proteinase-K atau RNAse
4.      Presipitasi DNA dengan etanol yang
dingin
5.      Pemurnian DNA dari ekstrak sel, dapat
menggunakan larutan fenol, isopropanol.
6.      Melarutkan pelet DNA dengan buffer TE
normal ddH2O
 B.     Isolasi DNA plasmid
DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada
DNA kromosom. Untuk memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan
perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur DNA kromosom..
Pertama, membran sel dilisis dengan penambahan detergen. Proses ini
membebaskan DNA kromosom, DNA plasmid, RNA, protein dan
komponen lain. DNA kromosom dan protein diendapkan dengan
penambahan potasium. DNA + protein + potasium yang mengendap
dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Supernatan yang mengandung DNA
plasmid, RNA dan protein yang tersisa dipisahkan. Kemudian
ditambahkan RNase dan protese untuk mendegradasi RNA dan protein.
Akhirnya DNA plasmid dapat dipresipitasi menggunakan etanol. 
Ekstraksi DNA dari organisme eukaryote (manusia,
hewan dan tumbuhan) dilakukan melalui proses
penghancuran dinding sel (lysis of cell walls),
penghilangan protein dan RNA (cell digestion) dan
pengendapan DNA (precipitation of DNA) dan
pemanenan. Berbagai teknik ekstraksi DNA telah
dikembangkan dari prinsip dasar tersebut, sehingga
saat ini muncul berbagai teknik ekstraksi dan
purifikasi DNA. Prinsip dasar ekstraksi DNA adalah
serangkaian proses untuk memisahkan DNA dari
komponen-komponen sel lainnya. Hasil ekstraksi
tersebut merupakan tahapan penting untuk langkah
berikutnya. Oleh sebab itu dalam pelaksanaannya
harus dilakukan dengan baik dan bebas kontaminasi.
 Apabila sampel yang digunakan adalah darah ayam,
maka bahan yang digunakan adalah :
1) Sampel darah ayam (2-3 ml)
2) Buffer lisis eritrosit (8,2 g NH4Cl pH 7,5 ; 1g
KHCO3; 37 mg EDTA dalam 1 L)
3) Buffer TE lisis (20 mM Tris dan 5 mM EDTA pH 7,5)
4) Normal TE (10 mM Tris dan 1 mM EDTA)
5) 6 M NaCl (larutkan sedikit demi sedikit NaCl saat
membuat larutan ini)
6) Proteinase K (10 mg/ml)
7) 10% SDS

· ALAT
1) Mikropipet dan tip dalam berbagai ukuran
2) Tabung Polipropilen/falcon (centrifuge tube) 15 ml
dan tabung eppendorf
3) Centrifuge dan waterbath
 Isolasi DNA Darah
1) Memasukkan 3 ml darah ke dalam tabung polipropilen
atau tabung falcon yang telah diberi antikoagulan EDTA lalu
dihomogenisasikan
2) Menambahkan 3 ml buffer lisis eritrosit (perbandingan
1:1) dan membiarkan 5-10 menit pada 4OC
3) Mensentrifugasi 2.500-3.000 rpm dalam suhu ruang
selama 5-10 menit
4) Membuang supernatan pelan-pelan tetapi jangan
sampai mengganggu pelet. Bila pelet masih berwarna
merah, mengulangi langkah 2 dan 3 sampai didapatkan
pelet putih. Pelet yang merah menunjukkan maih adanya sel
darah merah, sedangkan pelet putih menunjukkan sel
limfosit.
5) Menambahkan 800 μl TE lisis (cell lysis solution) ke
dalam pelet putih dan meresuspensi sampai homogen
dengan cara pipeting
6) Menambahkan 15 μl Proteinase-K dan 40 μl 10% SDS,
lalu meresuspend dan memindahakan ke dalam tabung
polipropilen steril
7) Memasukkan tabung ke dalam waterbath 50OC selama
1 jam
 Presipitasi DNA
1) Menambahkan 6 M NaCl sebanyak 1/3 volume
hasil kerja diatas dan me-resuspend sampai menjadi
homogen sehingga terlihat pemisahan warna larutan
2) Mensentrifugasi 2500 rpm selama 15-20 menit
sehinggan terbentuk pelet garam warna putih
3) Mengambil supernatan dan memindahkannya ke
tabung polipropilen baru
4) Menambahkan 2x volume etanol absolut
(tergantung hasil kerja di atas) dan membolak-balik
tabung perlahan-lahan sehingga tampak benang DNA
putih melayang di permukaan supernatan
5) Mensentrifugasi kecepatan 2.500 rpm selama 10
menit dan membuang supernatan hati-hati
6) Mengambil benang DNA dengan ujung tip pipet
dan melarutkan pelet DNA dalam 100-200 μl buffer TE
normal ke dalam tabung eppendorf dan kemudian
disimpan pada suhu 4OC, atau langsung melakukan
elektroforesis.
 memasukkan 3ml darah ketabung
polipropilen atau tabung falcon yang telah
diberi antikoagulan EDTA lalu
dihomogenisasikan, EDTA ini berfungsi
sebagai perusak sel dengan cara menikat ion
Mg (ion ini berfungsi untuk mempertahankan
integritas sel maupun mempertahankan
aktivitas enzim nuklease). Selanjutnya
menambahkan 3 ml buffer lisis eritrosis
(perbandingan 1:1) dan membiarkan 5-10
menit pada 4o C. Pada tahapan ini ini
termasuk dalam pemecahan dinding sel dan
membran inti secara kimiawi. Setelah itu
mensentrifugasi 2.500- 3.000 rpm dalam
suhu ruang selama 5- 10 menit. Tahapan ini
Langkah selanjutnya membuang supernatan
pelan- pelan tetapi jangan sampai
mengganggu pelet.Bila pelet masih berwarna
merah menunjukkan masih adanya sel darah
merah, sedangkan pelet putih menunjukkan
sel limfosit. Selanjutnya menambahkan 800 μl
TE lisis kedalam pelet putih dan meresuspensi
sampai homogen dengan cara pipeting.
Setelah itu menambahkan 15 ul protenase-K
dan 40 μl 10 % SDS, lalu meresuspen dan
memindahkan ke dalam tabung polypropilen
steril. Disini protense-K berfungsi untuk
denaturasi protein pada jaringan, sedangkan
SDS merupakan deterjen yang berfungsi
merusak dinding atau membran sel dan
mendenaturasi protein. Kemudian
memasukkan tabung ke dalam waterbath 50o
 Langkah selanjutnya adalah presitipasi DNA
atau proses pengendapan DNA, dengan
menambahkan 6 M NaCI sebanyak 1/3
volume hasil kerja diatas dan meresuspen
sampai menjadi homogen sehingga terlihat
pemisahan warna larutan. Penambahan NaCI
berfungsi untuk memekatkan, memisahkan
DNA dari larutan, dan mengendapkan DNA
sewaktu di campur dengan etanol. Kemudian
mensentrifugasi 2500 rpm selama 15-20
menit sehingga terbentuk pelet garam warna
putih. Langkah selanjutnya mengambil
supernatan dan memindahkannya ke tabung
propilen baru, kemudian menambahkan 2x
volume etanol absolut dan membolak-balik
tabung sehingga tampak benang DNA putih
melayang di permukaan supernatan.
Pemberian etanol berfungsi untuk
memisahkan molekul-molekul
nukleotida dari protein yang
mungkin masih
Kemudian ada.
mensentrifugasi dengan
kecepatan 2500 rpm selama 10
menit dan membuang supernatan
hati-hati. Selanjutnya mengambil
benang DNA dengan ujung tip pipet
dan melarutkan pelet DNA dalam
100 – 200 μl buffer TE normal ke
dalam tabung eppendorf dan
kemudian disimpan pada suhu 4oC.