Sekuen DNA membawa informasi

Transcription Translation

DNA mRNA Protein

 Ujung 5’ 2’-deoxyribose (sugar) Ujung 3’

C A C T T T A G A G C G
Bases

A (adenine) komplementer dengan T (thymine)

C (cytosine) komplementer dengan G (guanine)

C A C T T T A G A G C G

G T G A A A T C T C G C

DNA utas ganda

• “Sequencing” merupakan metode menentukan urutan
basa nukleotida, adenin, guanin, citosin, timin pada
sepotong DNA.

• Urutan nukleotida menentukan urutan asam amino, yang

akhirnya menentukan struktur protein dan fungsinya.

• Perubahan sekuens DNA dapat mengakibatkan

perubahan protein atau menyebabkan terbentuknya
protein non fungsional
Akibatnya dapat menimbulkan efek merugikan pada
organisme
Terdapat dua teknik sequencing:
Maxam & Gilbert, menggunakan chemical sequencing
Sanger, menggunakan dideoxynucleotides.

Sequencing yang modern menggunakan prinsip teknik Sanger.

Metode Sanger menggunakan dideoxynucleotide

triphosphates(ddNTPs) yang memiliki sebuah H pada
karbon-3 dari gula ribosa. Yang normal memiliki OH pada
deoxynucleotide triphosphates (dNTPs).

Dideoxynucleotides merupakan penghenti rantai. Dalam

reaksi sintesis jika dideoxynucleotide ditambahkan dan
bukan normal deoxynucleotide, sintesis akan berhenti karena
3’OH yang diperlukan untuk penambahan nukleotida
berikutnya tidak ada.
DNA Sequencing

A lot of modern DNA

sequencing is based
upon the following
modified nucleotides.
Metode Sanger dideoxy – ditemukan oleh Frederick Sanger memenangkan Nobel
1980
Karena tidak ada –
OH, replikasi
berhenti
 DNA utas tunggal dalam jumlah cukup sebagai
template DNA
 Primer yang sesuai (sepotong kecil DNA yang
berpasangan dengan template DNA dan berfungsi
sebagai starting point untuk replikasi
 DNA polymerase (enzim yang mengkopi DNA,
menambahkan nukleotida baru ke ujung 3 dari
template
 Sejumlah nukeotida normal
 Sejumlah kecil dideoxynucleotide yang dilabel
(radioaktif atau dengan pewarna fluorescent)
Template DNA direplikasi melibatkan nukeotida
normal tetapi secara random dideoxy (DD)
nukleotida diambil (dipasangkan).
Penambahan dideoxy nukeotida menyebabkan
reaksi berhenti
Hasilnya DNA dengan panjang yang bervariasi ,
masing-masing berhenti pada DDnukleotida
tertentu yang dilabel.
Karena tiap panjang yang berbeda bergerak
dengan kecepatan yang berbeda selama
elektroforesis, maka urutannya dapat
ditentukan.
DNA Sequencing

Metode original
dengan
menggunakan
radiolabeled DNA.

Sejumlah kecil
dideoxy
nucleotides
ditambahkan ke
reaksi polymerase
DNA.
DNA Sequencing

1.Terdapat lebih dari

satu utas DNA dalam
reaksi.

2. Tidak semua
nukeotida adalah
dideoxy.
 DNA Sequencing

1.Terdapat lebih dari

satu utas DNA dalam
reaksi.

2. Tidak semua
nukeotida adalah
dideoxy.

Sehingga multiple
terminated products
dihasilkan (tanda panah
merah)
DNA Sequencing
Digunakan fluorescently labeled dideoxy nucleotides (yang
dapat digabungkan dalam satu tabung) dan dipisahkan
dengan capillary electrophoresis dan dibaca dengan laser
saat DNAs melewati jendela detektor.

Komputer akan menghasilkan kromatogram seperti yang

terlihat dibawah ini.
Automated DNA sequencing – pada automated DNA
sequencing, deoxynucleotide radioaktif tidak
digunakan dan ke-4 reaksi dideoxy dikerjakan dalam
satu tabung tunggal.
Ini karena tiap ddNTPs dilabel dengan pewarna
flourescent yang berbeda.
Sehingga warna yang ada pada tiap fragmen yang
disintesa korespon dengan warna yang berikatan pada
dideoxynucleotide yang ditambahkan untuk
menghentikan sintesis fragmen.
Isi dari satu tabung reaksi dimasukkan ke satu jalur pada
gel dan dielektroforesis.
Sebuah flourimeter dan komputer dihubungkan ke gel
dan mendeteksi dan mencatat warna yang berikatan
dengan fragmen saat mereka melewati gel.
Urutan/sekuens ditentukan berdasarkan urutan warna
yang keluar dari gel.
 Capillary tubes

Reagents

Sample tray
goes here
DNA sequence alignment – memasangkan dua DNA
sequences untuk memaksimalkan kesamaannya
AACG
1. AACG dan AACG | | | |
AACG
AAGG
| | |
2. AAGG dan AACG AACG
1 mismatch

3. AACGGTATGC dan ATCGGGTTGC

AACG - GT ATGC 2 gaps
ATCG G GT -TGC
Best alignment – memasangkan dua sekuens dengan
sesedikit mungkin jumlah mismatches dan gaps

Score: tiap pasangan yang sama posisinya: +2;

tiap mismatch/ gap: -1

AACG AAGG AACG - GT A TGC

| | | | | | | ATCG G GT - TGC
AACG AACG
score = 8 score = 5 score = 16
 BLAST: http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/