TEKNIK MANIPULASI, REKOMBINASI

DAN UJI KUALITATIF/KUANTITATIF

DNA

ENDAH HANDAYANI (H31114515)

NURFITRI RAMDANI (H31114516)
ZULFAJRI (H31114305)
MUHAMMAD YASIN (H31114509)
 Latar Belakang

Kemajuan dibidang teknologi saat ini sudah berkembang sangat pesat,

banyak penemuan baru tentang biologi molekular, diantaranya yaitu adanya
sistem kloning. Pada hewan atau tumbuhan tertentu pengkloningan terbentuk
secara alami yaitu kebiasaan proses hewan atau tumbuhan bereproduksi
aseksual. Sedangkan dalam bioteknologi, kloning merujuk pada berbagai
usaha yang dilakukan manusia untuk menghasilkan salinan berkas DNA atau
gen, sel atau organisme.
 Latar Belakang

Seiring berkembangnya ilmu pengetahuan tersebut, muncullah

ilmu yang mempelajari mengenai pembentukan kombinasi materi
genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam
suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan
mengalami perbanyakan dalam suatu sel organisme lain yang
berperan sebagai sel inang yang dikenal sebagai teknologi DNA
rekombinan atau biasa disebut rekayasa genetika. Teknologi ini
memungkinkannya diperolehnya suatu produk dengan sifat tertentu
dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi
secara konvensional serta memadukan sifat dari dua jenis organisme
yang berbeda (organisme transgenik) dan lain-lain
 Rumusan Masalah

Adapun rumusan masalahnya yaitu:

O Bagaimana proses pemotongan dan penggabungan DNA dalam

manipulasi DNA ?

O Enzim apa saja yang berperan dalam manipulasi DNA?

O Metode apa yang digunakan untuk membuat molekul DNA

rekombinan?

O Bagaimana proses uji kualitatif dan kuantitatif DNA ?

Tujuan

O Untuk mengetahui proses pemotongan dan penggabungan DNA

dalam manipulasi DNA

O Untuk mengetahui enzim apa saja yang berperan dalam manipulasi

DNA.

O Untuk mengetahui metode yang digunakan untuk membuat molekul

DNA rekombinan.

O Untuk mengetahui bagaimana cara uji kualitatif dan kuantitatif DNA.

 Manipulasi DNA

Sampel murni DNA dibuat, lalu dilakukan pembentukan molekul DNA

rekombinan. Untuk menghasilkan molekul rekombinan, vektor dan DNA
yang akan diklon harus dipotong pada tempat-tempat tertentu dan kemudian
digabungkan menjadi satu dengan cara yang terkontrol. Pemotongan dan
penyambungan adalah dua contoh teknik manipulasi DNA. Seperti halnya
dipotong dan disambung kembali, molekul DNA dapat diperpendek,
diperpanjang, dibuat kopi menjadi molekul RNA atau molekul DNA baru dan
dimodifikasi dengan penambahan atau pengambilan gugus kimiawi tertentu.
 Manipulasi DNA
Hampir semua teknik manipulasi DNA menggunakan enzim yang dimurnikan, Di
dalam sel, enzim-enzim ini berperan serta dalam proses-proses yang penting seperti
replikasi dan transkripsi DNA, penghancuran DNA asing atau tidak dikehendaki
(misalnya DNA virus yang masuk sel), reparasi DNA yang mengalami mutasi, serta
rekombinasi antara molekul-molekul DNA yang berbeda. Setelah pemurnian dari
ekstrak sel, enzim-enzim tersebut dapat dicoba melaksanakan reaksi-reaksi dalam
kondisi yang artifisial. Walaupun reaksi enzimatik ini sering langsung dapat berjalan
tetapi kebanyakan tidak mungkin dijalankan dengan cara-cara kimia standar. Oleh
karena itu enzim yang murni sangat penting dalam rekayasa genetic dan suatu industri
yang penting telah mengembangkan preparasi, karakterisasi dan pemasarannya.
Manipulasi pemotongan dan penyambungan DNA dilakukan oleh enzim yang disebut
endonuclease restriksi (untuk pemotongan) dan ligase (untuk penyambungan)
 Pemotongan dan Penggabungan Molekul DNA

a. Pemotongan molekul DNA

Pada proses pemotongan molekul DNA, “gunting” yang dimaksud

bukanlah gunting yang biasa kita pakai untuk memotong sesuatu,
tetapi merupakan suatu enzim yang dihasilkan oleh mikroorganisme
tertentu. Enzim ini dikenal dengan nama enzim restriksi. Setiap
enzim restriksi mempunyai tempat pemotongan yang spesifik pada
suatu urutan molekul DNA. Sebagai contoh adalah enzim EcoRI
yang selalu memotong DNA pada posisi G !
Gambar 1. Mekanisme pemotongan enzim EcoR1
 b. Penggabungan molekul DNA

O Proses penggabungan (ligasi) antara dua molekul DNA menggunakan

lem/perekat berupa enzim, yang dikenal dengan nama enzim ligase. Enzim
ini berfungsi mensintesis pembentukan ikatan fosfodiester yang
menghubungkan nukleotida yang satu dengan nukleotida di sebelahnya.
Berikut adalah contoh penggabungan dua molekul DNA (A dan B) menjadi
molekul AB :
Enzim-enzim untuk Manipulasi DNA

O Nuklease

O Ligase

O Polimerase

O Enzim modifikasi (modifying enzim)

O Topoisomerase
 Rekombinasi

Secara alami, proses rekombinasi dapat terjadi sehingga

memungkinkan suatu gen dapat berpindah dari satu organisme ke
organisme lain. Persitiwa tersebut biasanya terjadi diantara organisme
yang memiliki kekerabatan yang dekat. Dengan kemajuan teknologi
molekuler, perpindahan gen dapat terjadi meskipun antara organisme
yang tidak memiliki hubungan kekerabatan. Misalnya gen manusia
yang dipindahkan ke bakteri atau ke hewan. Teknik penggabungan
molekul DNA tersebut dikenal sebagai Teknik rekombinan DNA.
 Rekombinasi

Terdapat dua macam rekombinasi genetik. Rekombinasi

spesifik situs (site-specific recombination) membutuhkan daerah

homolog beruntai ganda yang pendek namun identic pada

molekul-molekul DNA yang berekombinasi. Rekombinasi

semacam ini umumnya mengubah posisi relative segmen-segmen

kromosom. Rekombinasi umum (general recombination) terjadi

di antara molekul-molekul DNA yang homolog. Dalam

rekombinasi ini, pada umumnya tidak terjadi perubahan susunan

lokus gen pada kromosomnya masing-masing, namun terjadi

sintesis DNA
DNA Rekombinasi dan Isolasi Gen
Dengan perkembangan teknologi DNA rekombinan, telah
dimungkinkan untuk mengisolasi segmen DNA tertentu yang
terkadang mengandung seluruh atau sebagian gen, lalu
memeriksa struktur dan sifat-sifat lainnya secara rinci. Hal ini
memberikan keuntungan besar untuk pemahaman berbagai aspek
replikasi dan ekspresi material genetic pada level molekul yang
sangat detail.
DNA rekombinan merupakan molekul yang dibentuk secara
buatan yang mengandung segmen-segmen DNA dari organisme-
organisme yang berbeda. Jika salah satu segmen membawa orgin
of replication, maka molekul rekombinan (atau molekul
gabungan) memiliki potensi untuk replikasi di dalam organisme
yang mampu mengenali origin tersebut. Dalam situasi seperti ini,
segmen yang membawa origin (yang memungkinkan terjadinya
replikasi) disebut vector
Terdapat beberapa metode yang tersedia untuk membuat molekul DNA
rekombinan. Salah satu pendekatan yang paling banyak digunakan
memanfaatkan ujung untai tunggal segmen DNA yang dibentuk oleh
endonukleus restriksi tipe II seperti EcoRI. Fragmen-fragmen yang
dihasilkan enzim ini mengandung ujung-ujung 5’ yang overlap. Ujung-
ujung untai tunggal pendek ini secara spontan bergabung satu sama lain
dalam kondisi suhu dan kekuatan ionic yang sesuai, melalui pemasangan
komplementer. Proses ini disebut annealing. Molekul yang bergabung
kembali ini diikat melalui empat pasang basa, tetapi terdapat nick pada
setiap untai. Nick ini bisa digabung kembali oleh DNA ligase
 Vektor yang sering digunakan yaitu plasmid bakteri. Plasmid ini merupakan
molekul DNA lingkar berukuran 3-100 kb. Bentuk lingkar sangat penting untuk
replikasinya. Jika suatu plasmid dipotong secara enzimatik hanya pada satu sisi
oleh misalnya EcoRI, maka fragmen linear yang diperoleh bisa di-anneal oleh
fragmen yang telah dibentuk dengan pemotongan DNA lain dengan EcoRI. Proses
ini menghasilkan molekul gabungan lingkar yang disegel oleh DNA ligase.
Molekul gabungan lingkar ini kemudian dimasukkan ke dalam inang yang sesuai,
misalnya E. coli melalui suatu proses yang disebut sebagai transformasi. Proses ini
melibatkan reaksi sel bakteri dan CaCl2 pada suhu rendah (untuk memungkinkan
pengambilan DNA) diikuti dengan inkubasi bersama DNA dalam kondisi yang
sesuai. DNA asing bereplikasi dalam kendali vektor. Jika DNA asing membawa
suatu gen utuh, maka kemungkinan gen tersebut akan diekspresikan dalam bakteri.
Jenis pendekatan ini telah bermanfaat dalam produksi insulin manusia dalam
bakteri. Keseluruhan teknik tersebut kadangkala disebut kloning gen
Uji Kualitatif dan Kuantitatif DNA

Pengukuran molekul DNA dapat dilakukan secara

kualitatif dan kuantitatif. Target yang ingin didapatkan
adalah hasil ekstraksi DNA murni dan konsentrasi
yang tinggi. Untuk menguji kuantitatif dan kualitatif
isolate DNA dan RNA maka dapat dilakukan
pengukuran dengan menggunakan spektrofotometri
UV-Vis dan elektroforesis gel agarosa.
 Uji Kuantitatif DNA

Uji kuantitatif DNA/RNA dengan menggunakan nanodrop

spektrofotometer yang mempunyai teknologi nano atau
spektrofotometer sederhana. DNA murni dapat menyerap cahaya
ultraviolet, karena adanya basa purin dan pirimidin. Pita ganda
DNA/RNA dapat menyerap cahaya UV pada 260 nm sedangkan
kontaminan protein atau fenol akan menyerap cahaya pada 280
nm sehingga kemurnian DNA/RNA dapat diukur
 Uji Kualitatif DNA

Metode standar yang digunakan untuk identifikasi,

pemisahan dan purifikasi fragmen DNA dilakukan dengan
menggunakan gel agarosa. Migrasi elektroforesis DNA
melalui gel agarosa dipengaruhi oleh faktor ukuran dan
konformasi molekul DNA, konsentrasi bubuk agarosa,
arus listrik dan suhu. Penambahan EtBr digunakan untuk
alat identifikasi dan mengukursemikualitatif fragmen
DNA yang terpisah dalam gel, karena EtBr akan terikat
diantara dua untai DNA sehingga pita DNA dalam gel
agarosa akan berpendar.
 Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel
DNA berdasarkan ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya.
Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa
dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari
beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa. Molekul DNA bermuatan
negative sehingga didalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks
gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin
rendah laju migrasinya.
 Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan
membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen
molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui
ukurannya. Visualisasi DNA selanjutnya dilakukan dibawah paparan
sinar ultraviolet. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel
direndam didalam larutan etidium bromide sebelum dipaparkan
diatas sinar ultraviolet
TERIMA KASIH…