KLASIFIKASI DAN IDENTIFIKASI

PROKARIOT
 REVIEW: KLASIFIKASI MAKHLUK HIDUP
 Ingat klasifikasi 3 domain !!!
 KLASIFIKASI TIGA DOMAIN
• Klasifikasi tiga domain dibuat berdasarkan hubungan filogenetik
(kekerabatan gen) dengan cara membandingkan urutan sekuen
gen molekul tertentu organisme.

• rRNA (Ribosomal RNA) dipilih sebagai molekul yang sangat baik

digunakan untuk menentukan hubungan filogenetik organisme.
– Karena rRNA mempunyai fungsi yang konstan, tersebar
secara universal dan tersusun oleh beberapa daerah sekuen
nukleotida yang terkonservasi (stabil tidak mudah mengalami
mutasi) di dalam semua sel.

• Fokus sekuensing prokariot terletak pada 16S rRNA, sedangkan

pada eukariot terletak pada 18S rRNA.
 Sekuensing rRNA

a. Sel diekstrak untuk mengisolasi DNA

b. Gen pengkode rRNA diisolasi dan diduplikasi kopi gen dengan teknik
PCR
c. Gen disekuensing (pembacaan urutan baca nukleotida)
d. Urutan basa nukleotida dianalisis dengan komputer
e. Sekuen gen(urutan basa nukleotida) rRNA antara organisme
disejajarkan dan dianalisis perbedaannya.
KERAGAMAN PROKARIOT
(KLASIFIKASI PROKARIOT)
KERAGAMAN / KLASIFIKASI BAKTERI

• Paling sedikit ada 18 filum bakteri yang telah

diketahui melalui telaah kultur di laboratorium
dan melalui sekuen gen 16S rRNA.
Pohon Filogenetik Bakteri Berdasarkan 16SrRNA
CONTOH HIRARKI KLASIFIKASI BAKTERI
 KERAGAMAN / KLASIFIKASI ARCHAEA

• Archaea dibedakan menjadi 2 filum

• Filum Euriarkeota, terdiri dari genus Halobacterium,

Haloferax, Natronobacterium, Methanobacterium,
Thermoplasma, Ferroplasma, Picrophillus, Thermococcus,
Pycrococcus, Archaeoglobus, dan Ferroglobus.

• Filum Krenarkeota, terdiri dari genus Sulfolobus,

Acidianus, Thermoproteus, Pyrobaculum, Pyrodictium,
Pyrolobus, Ignicoccus, dan Staphylothermus.
KERAGAMAN / KLASIFIKASI ARCHAEA
 METODE IDENTIFIKASI
BAKTERI
1. Karakterisasi mikroskopis:
– Pewarnaan sederhana
– Pewarnaan diferensial
2. Karakterisasi aktivitas biokimiawi
3. Identifikasi molekuler (PCR 16S rRNA)
 Karakterisasi Mikroskopis
• Karakterisasi mikroskopis dilakukan dengan cara
membuat preparat kering (olesan tipis) bakteri
(kultur murni) pada kaca objek dan diberi zat
warna lalu diamati dibawah mikroskop.

• Karakterisasi mikroskopis membutuhkan:

1) Preparat bakteri (dari kultur murni)
2) Zat pewarna
3) Mikroskop
1. Preparat / Olesan Bakteri
• Olesan bakteri harus disiapkan sebelum melakukan
pewarnaan bakteri.

• Hal-hal yang harus diperhatikan pada pembuatan

preparat bakteri:
– Kaca objek harus bebas dari debu dan lemak
– Pembuatan olesan tipis sangat penting, olesan yang
baik dapat terlihat apabila kering memperlihatkan
lapisan tipis berwarna putih.
– Fiksasi panas diperlukan agar sel melekat pada kaca
objek dan olesan tidak mudah tercuci oleh pembilasan.
 2. Pewarnaan Bakteri
• Pewarnaan bakteri menggunakan zat pewarna khusus.

• Zat pewarna merupakan senyawa organik yang terdiri

dari cincin benzen+kromofor (kromogen), dan gugus
auksokrom

• Zat pewarna mengikat komponen makroseluler

seperti protein atau asam nukleat tergantung pada
muatan elektron kromogen dan komponen seluler
yang diwarnai.
 Zat Pewarna Bakteri
• Pewarna Asam: pewarna bersifat anionik berarti
kromogen bermuatan negatif sehingga mempunyai
afinitas kuat terhadap makroseluler bakteri bermuatan
positif seperti protein sel. Contoh zat warna: tinta
india/nigrosin

• Pewarna Basa: pewarna bersifat kationik berarti

kromogen bermuatan positif sehingga mempunyai
afinitas kuat terhadap makroseluler bakteri bermuatan
negatif seperti dinding sel dan asam nukleat. Contoh zat
warna: methylene blue, chrystal violet, carbol fuchsin
 Teknik Pewarnaan
• Pewarnaan Sederhana: satu macam pewarna.
– Penampakan bentuk morfologi dan penataan sel.

• Pewarnaan Diferensial: dua macam pewarna.

– Pemisahan kelompok:
• Pewarnaan Gram
• Pewarnaan Tahan Asam
– Penampakan struktur sel:
• Flagel
• Kapsul
• Spora
 Pewarnaan Sederhana
• Pewarnaan sederhana bertujuan untuk
mengetahui bentuk sel bakteri.

• Olesan bakteri hanya diwarnai dengan satu

macam pewarna.

• Zat pewarna yang dapat digunakan adalah

methylene blue, atau chrystal violet, atau carbol
fuchsin.
 Pewarnaan Negatif
• Pewarnaan negatif membutuhkan zat pewarna
asam seperti tinta india / nigrosin.

• Zat pewarna tidak mewarnai permukaan sel

tetapi sel bakteri yang tidak terwarnai akan
tampak jelas dengan latar yang gelap.

• Preparat dibuat tanpa fiksasi panas artinya

kondisi sel masih hidup sehingga bentuk dan
ukuran sel secara alami dapat diamati.
 Pewarnaan Gram
• Pewarnaan bertujuan untuk membedakan bakteri ke
dalam dua kelompok yaitu Gram Positif dan Gram
Negatif.

• Reaksi pewarna didasarkan pada perbedaan

komposisi kimiawi penyusun dinding sel bakteri.

• Pewarnaan Gram menggunakan 4 zat pereaksi yaitu:

chrystal violet (pewarna pertama), lugol/iodin
(mordan), alkohol 96% (pemucat), dan safranin
(pewarna kedua).
Pewarnaan Gram
 Identifikasi Aktivitas Biokimia
• Aktivitas biokimia mikrob mempunyai arti penting
dalam taksonomi.

• Aktivitas biokimia di dalam sel disebut juga

metabolisme seluler, transformasi biokimiawi
dikendalikan oleh enzim dapat berlangsung di
dalam dan di luar sel.
– Enzim ekstraseluler: hidrolisis pati, lipid, kasein, gelatin
– Enzim intraseluler: fermentasi karbohidrat, produksi
H2S, uji katalase, pemanfaatan sitrat, uji produksi indol,
dsb.
1. Uji Fermentasi Karbohidrat

• Kemampuan bakteri mendegradasi dan

memfermentasi karbohidrat disertai produksi
asam atau asam dan gas.
• Uji ini menggunakan media TSIA (Triple Sugar
Iron Agar).
1. Uji Fermentasi Karbohidrat

a b c d
2. Uji Produksi Indol
• Uji ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan
bakteri menghasilkan enzim triptofanase untuk
mengubah asam amino triptofan menjadi indol.

• Uji ini menggunakan media SIM yang

mengandung triptofan dan adanya indol
dideteksi dengan reagen Kovac’s yang
menghasilkan cincin merah pada permukaan
media.
2. Uji Produksi Indol
3. Uji Pemanfaatan Sitrat
• Bertujuan untuk membedakan bakteri yang
dapat menghasilkan enzim sitrase untuk
memanfaatkan sitrat sebagai satu-satunya
sumber karbon.

• Uji ini menggunakan media Simmons Citrate

Agar
3. Uji Pemanfaatan Sitrat
4. Uji Katalase
• Uji ini bertujuan untuk membedakan bakteri
penghasil enzim katalase untuk mendegradasi
hidrogen peroksida.

• Uji ini menggunakan pereaksi H2O2 3%

• Katalase (+) ditandai dengan terbentuknya

gelembung gas pada olesan bakteri yang
dicampur dengan H2O2 3%.
4. Uji Katalase
• Ilmu yang membahas mengenai klasifikasi
disebut taksonomi.
• Bergey’s manual merupakan referensi resmi
internasional yang membahas mengenai
klasifikasi bakteri.