ISOLASI DNA

DNA ?

Molekul yang membawa

instruksi/ kode genetik
yang digunakan untuk
pertumbuhan,
perkembangan, fungsi, dan
reproduksi seluruh
organisme hidup dan virus.
DNA nukleosom
chromatinchromosom
 Isolasi DNA

• Tehnik untuk mendapatkan DNA dari makhluk hidup

• Tujuan : memisahkan DNA dalam suatu sel darizat-zat lain selain DNA,
seperti protein, lemak, dan karbohidrat
• Sediaan isolasi DNA : whole blood, rambutm, saliva, kuku, jaringan,
tulang, sel epitel, urin, buccal swab
 Prinsip Isolasi DNA

Ada 4:
1. Lisis
2. Ekstraksi
3. Presipitasi
4. Rehidrasi
 1. Lisis

• Untuk menghancurkan dinding sel atau membran sel

• Ada beberapa cara:
- Fisik: menggerus sampel dengan mortar dan pestle dalam nitrogen
cair, metode freezing thawing, radiasi
- Kimiawi: menggunakan detergen atau sodium dodecyl sulphate
- Enzimatik : lysozyme
 2. Ekstraksi

• Memisahkan DNA dari kontaminan-kontaminan lainnya yaitu komponen-

komponen penyusun yang lain seperti polisakarida, protein melalui proses
sentrifugasi
• Akan dihasilkan 2 fase: fase organik pada bagian bawah dan fase aquoeus (air)
pada bagian atas
DNA dan RNA →pada fase aquoeus
Protein yang terdenaturasi → pada interfase
Lipid → pada fase organik
• RNA dapat dihilangkan menggunakan RNAse (enzim yang dapat merusak RNA)
 3. Presipitasi

• DNA dipekatkan melalui presipitasi menggunakan etanol atau

isopropanol
• Isopropanol dan etanol akan mengendapkan DNA pada fase aquoeus
→DNA menggumpal membentuk struktur fiber→sentrifugasi
→berbentuk pellet
 4. Rehidrasi

• Pemurnian DNA → mengeringkan atau menguapkan

Praktikum
 Tujuan

1. Memahami prinsip-prinsip isolasi DNA

2. Mampu melakukan isolasi DNA dari sampel darah
Alat

Rak rainbow
Bahan
 Cara Kerja

1. Siapkan sampel yang akan digunakan

2. Sterilkan alat yang akan digunakan:
Spray meja kerja, mikropipet, gloves etc menggunakan alkohol 70% →
usap menggunakan facial tissue.
Pasang plastic wrap pada area meja kerja (membuat Meja Bersih)
3. Isolasi DNA dari sampel darah sesuai petunjuk kit yang digunakan
(Genomic DNA Mini Kit)
 Isolasi DNA Whole Blood

TAHAP PERSIAPAN SAMPLE

1. Letakkan 150 µl sample darah ke microsentrifuge tube ukuran 1,5 ml
2. Tambahkan RBC lysis buffer sebanyak 3 kali volume sample, campur
(homogenkan sampel) dengan membolak-balikkan tube.
3. Inkubasi tube selama 10 menit dalam suhu ruangan.
4. Sentrifuse selama 5 menit pada 5.000 rpm lalu buang supernatant
5. Tambahkan 50 µl RBC lysis buffer
TAHAP LISIS SEL
6. Tambahkan 100 µl GB buffer ke dalam Microsentrifuge tube,
campur dengan cepat
7. Inkubasi pada 60oC selama 10 menit, bolak-balikkan tube
setiap 3 menit.
8. Hangatkan Elution buffer (100 µl per sampel) pada 60o (Untuk
tahap elusi DNA)
TAHAP DNA BINDING
9. Tambahkan 100 µl absolute ethanol ke dalam tube, campur dengan
cepat selama 10 detik.
10. Letakkan GD column ke collection tube 2 ml.
11. Pindahkan campuran ke dalam GD column
12. Sentrifuse pada11.000 rpm selama 5 menit.
13. Buang collection tube lalu pindahkan GD column ke collection tube
baru.
TAHAP WASH
14. Tambahkan 200 µl W1 buffer ke GD column lalu sentrifuse pada 11.000 rpm
selama 30-60 detik.
15. Buang sisa pada collection tube, letakkan GD column kembali ke collection
tube
16. Tambahkan 300 µl wash buffer (pastikan sudah ditambah etanol) ke GD
column
17. Sentrifuse pada 11.000 rpm selama 30-60 detik.
18. Buang sisa pada collection tube, letakkan GD tube kembali ke collection tube.
19. Sentrifuse pada 11.000 rpm selama 3 menit.
TAHAP DNA ELUTION
20. Pindahkan GD column ke microsentrifuge tube 1,5 ml
21. Tambahkan 50 µl elution buffer yang sudah dihangatkan ke GD column
22. Biarkan selama 3 menit
23. Sentrifuse pada 11.000 rpm selama 30 detik.
 Isolasi DNA Bakteri

TAHAP PREPARASI SAMPEL

1. Mempersiapkan sel bakteri hasil kultur
2. Memindahkan sel bakteri kedalam Microsentrifuge Tube ukuran 1.5
ml sebanyak ml dari kultur media cair
3. Melakukan centrifuge terhadap Microsentrifuge Tube 1.5 ml yang
berisi sel bakteri selama 1 menit dengan kecepatan 11.000 rpm
dengan menggunakan mesin centrifuge, kemudian membuang
supernatant
4. Tambahkan 180 μl GT buffer, kemudian campurkan menggunakan
vortex/pipet.
5. Tambahkan 20 μl Proteinase K.
6. Melakukan inkubasi larutan kembali selama 10 menit dalam suhu
60°C, dan bolak-balik microsentrifuge tube berisi larutan tiap 3
menit
TAHAP LYSIS
7. Menambahkan 200µl GB Buffer ke dalam campuran
8. Menghomogenkan campuran dengan menggunakan vortex selama 10
detik
9. Menginkubasi campuran pada suhu 70°C selama 10 menit, dan
membolak-balikkan microsentrifuge tube setiap 3 menit
10. Menginkubasi Elution Buffer (200µl tiap sampel) dalam microcentrifuge
tube terpisah pada suhu 70°C bersamaan dengan inkubasi campuran
TAHAP DNA BINDING
11. Menambahkan 200µl absolute ethanol ke dalam campuran dan
kemudian segera dihomogenkan dengan cara mengocoknya. Jika
muncul endapan, sebisa mungkin hilangkan menggunakan pipet
12. Memasang GD Column pada Collection Tube berukuran 2ml
13. Memindahkan campuran ke dalam GD Column kemudian centrifuge
dengan kecepatan 11000 rpm selama 2 menit
14. Membuang Collection Tube yang berisi cairan dan memasang GD
Column pada Collection Tube baru berukuran 2ml
TAHAP WASH
15. Membuang Collection Tube yang berisi cairan dan memasang GD
Column pada Collection Tube baru berukuran 2ml
16. Mensentrifuge dengan kecepatan 11000 rpm selama 30 detik
17. Membuang cairan yang ada di dalam Collection Tube dan menaruh
GD Column kembali ke Collection Tube
18. Menambahkan 600 µl Wash Buffer ke dalam GD Column
19. Mensentrifuge dengan kecepatan 11000 rpm selama 30 detik
20. Membuang cairan yang ada di dalam Collection Tube dan menaruh
GD Column kembali ke Collection Tube
21. Mensentrifuge dengan kecepatan 11000 rpm selama 3 menit
TAHAP ELUTION
22. Memindahkan GD Column yang telah kering kedalam 1.5 ml
Microsentrifuge Tube
23. Tambahkan 100 μl Elution Buffer yang sebelumnya sudah di inkubasi
kedalam GD Column yang berada dalam microsentrifuge tube,
diamkan selama 3 menit
24. Melakukan centrifuge terhadap GD Column yang berisi Elution
Buffer dan berada dalam microsentrifuge tube selama 30 detik
dengan kecepatan 11.000 rpm
BERSAMBUNG...