Fitokimia.

KROMATOGRAFI
Pengertian

Fitokimia
adalah segala jenis zat kimia atau nutrien yang diturunkan
dr sumber tumbuhan termasuk sayuran, dan
buah2an.

Fitokimia berasal dr kata : Phyto Chemical

phyto artinya tumbuhan
chemical artinya zat kimia
 PEMISAHAN
• Pemisahan hasil ekstraksi tumbuhan dapat dilakukan dengan teknik
kromatografi.

• Kromatografi adalah suatu metode fisik untuk pemisahan yang

didasarkan atas perbedaan afinitas senyawa-senyawa yang sedang
dianalisis terhadap terhadap 2 phase (fasa)
Yaitu : - Fasa diam (stasioner)
- Fasa gerak (mobil)

• Campuran senyawa dapat mengalami absorbsi dan desorpsi oleh fasa

dan secara berturut-turut sehingga berurutan , disini fasa gerak akan
akan melarutkan senyawa-senyawa tersebut dan terjadi proses
pemisahan dikarenakan setiap campuran senyawa memiliki kelarutan
diantara dua fasa.
Fasa diam
dalam kromatografi: berupa Zat padat dan zat cair

Zat padat : Silika

Alumina
• Sebagai adsorbens, mempunyai kemampuan mengadsorbsi bahan-bahan yang akan
dipisahkan
• Dapat digunakan sebagai bahan pengisi kolom pada
- Kromatografi kolom gravitasi.
- Kromatografi tekanan tinggi
- Sebagai bahan pembuat pelapis tipis untuk KLT

Zat Cair
• Contoh : pada kromatografi kertas, fasa diamnya berupa air yang diabsorbsi oleh molekul-
molekul selulose pada kertas
• Pada kromatografi gas fasa diam berupa zat yang dilekatkan pada kapiler dan mempunyai
pori dengan ukuran yang sama.
Fasa Gerak
Dapat berupa :
• Gas pada Kromatografi Gas (GC)
• Cair pada Kromatografi kertas dan
Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
• Jika fasa gerak berupa gas disebut gas
pembawa /gas vektor
• Jika berupa zat cair disebut Eluen (pelarut)
Beberapa jenis kromatografi berdasarkan perbedaan sifat fasa-
fasanya :

1. Kromatografi cair- padat dengan fasa gerak cair dan

fasa diam padat
2. Kromatografi gas - padat dengan fasa gerak gas dan
fasa diam padat
3. Kromatografi cair- cair dengan fasa gerak cair dan fasa
diam cair
4. Kromatografi gas-cair dengan fasa gerak gas dan fasa
diam cair

Untuk no 2 dan 4 disebut juga dengan Kromatografi Gas.

• Perbedaan berdasarkan pada sifat fenomena yang terjadi pada
pemisahan al :
- Kromatografi adsorbsi
- Kromatografi partisi
- Kromatografi lapis penukar ion
- Kromatografi afinitas /filtrasi gel

• Perbedaan berdasarkan teknik pemisahan :

- Kromatografi lapis tipis (KLT)
- Kromatografi kertas
- Kromatografi kolom (KK)
- Kromatografi Gas
- Kromatografi cair bertekanan tinggi

Yang sering digunakan adalah KLT dan KK

 Kromatografi Lapis Tipis
Prinsip dari KLT adalah adsorbsi

• Sampel (yang sudah dilarutkan), ditotolkan diatas fase diam ,

senyawa-senyawa dalam sampel akan terelusi, dengan kekuatan
elektrostatis akan menarik senyawa diatas fase diam karena
adanya sifat fase gerak (berkemampuan melarutkan senyawa)
• Senyawa-senyawa yang mempunyai kepolaran lebih rendah akan
terelusi lebih cepat dibanding dengan senyawa polar karena
akan terikat lebih kuat pada Silika yang mengandung silanol
(SiOH2) yang memiliki afinitas lebih kuat terhadap senyawa
polar.
• Fungsi dari KLT adalah untuk melihat kemurnian suatu senyawa
organik.
• Dalam analisis dapat dilakukan mengubah
pelarut beberapa kali (minimal 3 macam)
• Hasil elusi tetap menampakkan satu noda,
maka sampel yang ditotolkan adalah murni
• KLT juga juga dapat menampakkan jumlah
senyawa-senyawa dalam campuran sampel.
Perlengkapan KLT antara lain adalah :

• Bejana kromatografi terbuat dari kaca dilengkapi dengan

penutup yang rapat, untuk tempat eluen
• Fasa diam, berupa berupa selapis tipis (0,25 mm)
sepotong kaca, plastik atau aluminium datar yang
dilapisi Silika gel atau adsorben yang lain seperti :
- Alumina,
- Kieselguhr atau
- Selulose
dengan bantuan penghubung Calsium Sulfat anhidrat,
tepung kanji, atau suatu polimer organik.
• Pipa Kapiler dari kaca
• Sampel sebanyak 1 ul dari larutan encer (2-5%)
ditotolkan pada satu titik diatas fase diam
dengan pipa kapiler,titik tersebut letaknya diatas
batas pelarut.
• Penotolan harus tepat untuk menghasilkan noda
yang baik.
• Kemudian fase diam dimasukkan kedalam bejana
yang berisi eluen/pelarut/solvent murni atau
campuran yang telah dijenuhkan terlebih dahulu.
• Maka eluen akan mengelusi senyawa-senyawa
dalam sampel sepanjang fasa diam
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam
pemilihan eluen adalah
• Eluen yang terlalu polar akan mengelusi
semua senyawa dalam sampel
• artinya faktor menghambat elusi tidak cukup
kuat dan kepolaran senyawa-senyawa dalam
sampel berpengaruh terhadap pemilihan
eluen (berhubung dengan sifat kepolarannya)
dimana bagian dalam bejana harus dijenuhkan
terlebih dahulu dengan eluen
Penampakan Noda.
Adanya penampakan noda, terutama digunakan bila yang akan dipisahkan
bukan senyawa-senyawa yang berwarna.

Metode yang digunakan adalah :

a. Sinar UV dimana beberapa senyawa akan nampak sebagai
noda yang berpendar
b. Indikator fluoresensi yang sudah terdapat dalam plat lapis
tipis yang digunakan (ada tanda GF untuk silika gel) maka plat
tersebut akan berfluoresensi jika diletakkan dibawah lampu UV dan
senyawa-senyawa akan muncul sebagai noda gelap
c. Iod bereaksi dengan sebagian besar senyawa organik membentuk
senyawa kompleks warna kuning atau coklat.
Noda dapat terdeteksi dengan meletakkan plat kering dalam bejana
yang berisi kristal iod, tertutup rapat sehingga bejan jenuh dengan
uap iod
d. Atomisasi dilakukan dengan meletakkan suatu pereaksi diatas plat
sehingga akan terjadi reaksi senyawa tersebut.
Beberapa pereaksi semprot untuk penampak noda.

1. Anhidrid Asam Asetat – Asam Sulfat pekat (pereaksi

Lieberman –Buchardad), untuk senyawa steroid dan terpenoid
2. Anisaldehid- Asam sulfat, untuk gula, steroid dan terpenoid
3. Aluminium klorida, untuk flavonoid
4. Antimon klorida, untuk flavonoid
5. Cerium sulfat – asam sulfat, untuk untuk semua senyawa
organik .
6. Pereaksi Dragendorf (Munier), untuk Alkaloid
7. Magnesium Asetat, untuk Antraquinon
8. Potasium Hidroksida Metanolik, untuk kumarin dan
Antraquiinon.
 2.Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
• Penggunaan plat KLT dengan ketebalan plat 0,5 – 2 mm.
• Ukuran plat umumnya 20 x 20 cm atau 20 x 40 cm
• Untuk sampel 10 -100 mg dapat dipisahkan menggunakan adsorben silika gel atau
alumina
• Plat KLT dapat dibuat sendiri atau dibeli.
• Sebelum ditotolkan pada plat KLT sampel dilarutkan dalam pelarut
• Pelarut yang digunakan umumnya pelarut mudah menguap seperti n-heksana, dikloro
metana atau etil asetat, jika pelarut tak mudah menguap akan terjadi pelebaran pita
• Pelarut yang digunakan sebagai fasa gerak antara lain :
- n-heksana – etil asetat
- n-heksana- aseton
- kloroform – metanol
• Setelah ditotol senyawa yang terpisah dapat diamati dibawah SUV
• Hasil penotolan disemprot dengan dengan pereaksi penampak noda, kemudian dikerok
dari plat
• Selanjutnya diekstraksi dari adsorbens dengan pelarut yang sesuai ( 5ml pelarut untuk 1
gram adsorben)
• Kemudian disaring.
 Kromatografi Sentrifugal
• Prinsipnya adalah kromatografi klasik dengan aliran
fasagerak yang dipercepat oleh gaya sentrifugal.
• Contoh alat kromatografi ini sering dipakai adalah
kromatotron
• Perbedaan besar antara kromatotron dengan KLT
sentrifugal adalah rotornya tidak mendatar tetapi
miring.
• Bagian utama alat ini adalah plat kaca bundar bergaris
tengah 24 cm yang dilapisidengan adsorben yang
cocok sehingga terbentuk pemisahan preparatif.
 Kromatografi Kolom
• Prinsip kromatografi kolom adalah suatu teknik pemisahan yang
didasarkanpada peristiwa adsorpsi
• Sampel yang berupa larutan pekat diletakkan pada ujung kolom
• Dengan adanya gravitasi atau karena bantuan tekanan, maka eluen/pelarut
akan melewati kolom dan proses pemisahan akan terjadi.
• Eluen/pelarut akan digunakan mulai dari yang non polar dan secara gradien
kepolarannya hingga pemisahan dapat terjadi, ini karena adanya afinitas
senyawa pada adsorbendan perbedaan kelarutan senyawa pada
eluen/pelarut.
• Sebaiknya pengisian kolom menggunakan pelarut air untuk membasahi
dinding kolom.
• Saat sampel diletakkan diujung kolom maka saat itu juga sudah terjadi
peristiwa adsorbsi oleh permukaan adsorbens
• Eluen mengalir secara kontinu kedalam kolom akan menyebabkan
peristiwa adsorpsi dan desorpsi senyawa-senyawa sampel.
• Cairan yang keluar dari kolom ditampung dan
dilakukan analisis menggunakan KLT untuk melihat
hasil pemisahannya.
• Adsorben yang digunakan adalah Silika (SiO2) ,
Selulose dan Alumina
• Besarnya butir/ granulasi adsorben kromatografi
kolom harus lebih besar dari KLT yaitu antara 50
-200 um
• Secara umum jumlah adsorben yang digunakan 30-
50 gr untuktiap gram sampel yang akan
dipisahkan.
• Eluen atau pelarut yang digunakan adalah campuran dua macam pelarut
• Awal elusi dimulai dengan eluen yang paling non polar akan membawa
senyawa-senyawa yg kurang terikat pada adsorben.
• Sepanjang proses elusi, komposisi eluen dapat divariasi dengan
penambahan pelarut yang lebih polar
• Sehingga senyawa-senyawa akan terelusi kebawah kolom secara berurutan
berdasarkan kepolarannya.
• Penggunaan beberapa eluen harus dihindari saat digunakan sebagai
adsorben seperti alumina, atau silika gel dalam bentuk asam atau basanya.
• Pelarut sangat polar seperti , Metanol , Air dan Asam juga harus hati-hati
karena akan melarutkan adsorben dalam jumlah kecil.
• Kecepatan elusi sebaiknya d ibuat konstan /lambat sehingga senyawa
berada dalam keseimbangan antara fasa diam dan fasa gerak.
• Tetapi jika kecepata elusi terlalu kecil maka senyawa-senyawaakan terdifusi
kedalam eluen sehingga pita makin lama akan menjadi semakin lebar,
akibatnya pemisahan tidak dapat berlangsung baik.
• Kecepatan elusi yang besar dapat dilakukan jika yang akan dipisahkan
adalah campuran memiliki kepolaran yang sangat berbeda.
TERIMA KASIH