PENGANTAR KROMATOGRAFI

Acuan
1. Watson,D.G., 2000; Pharmaceutical Analysis,
1rst ed., second printed, Harcourt Publ.,
Toronto
2. Jimenez, J.L, 2003, Lecture Chromo-5:
Ion Chromatography

Harjana 2008
TUJUAN KULIAH KROMATOGRAFI
Setelah mengikuti kuliah Kromatografi mhs
mampu
• Menjelaskan asas pemisahan pada dan jenis
kromatografi
• Menjelaskan parameter2 kinerja kromatografi
• Menjelaskan penyebab terjadinya pelebaran zona
• Memahami cara-cara validasi dan SST
• Memilih sistem kromatografi
• Memanfaatkan kromatografi utk uji kualitatif dan
kuantitatif

Harjana 2008
 Dasar-dasar Kromatografi

Proses :

• Sample dimuatkan pada fase diam polar

• Pelarut polar dan senyawa hidrofil akan lebih kuat
teradsorbsi pada fase diam dari pada non-polar pelarut
non-polar dan senyawa lipofil
• Fase gerak/eluen akan “mendorong” atau menarik
senyawa keluar dari kolom (KK) atau ke atas lempeng
(KLT)

• Dalam kromatografi konsep utama yang harus

diperhatikan adalah polaritas atau lipobilitas
Kromatogr. Kolom
M. Twettz
Harjana 2008
 A

KLT

Harjana 2008
BENTUK PARTIKEL FASA DIAM SILIKA GEL

Harjana 2008
 Polaritas & Kekuatan Tarik Intermolekul
• Senyawa hidrofil akan menempel pada silica gel lebih kuat
dibanding senyawa yang lipofil, karena perbedaan daya tarik antar
molekul akibat interaksi antar kutup -
+ O OH
+
Si Si
Silica gel, [SiO2]n -
O O
-

• Akibatnya makin lipofil senyawa makin mudah melewati fase diam.

Fase gerak non polar akan memudahkan membawa senyawa lipofil ,
karena senyawa lebih mudah larut dalam pelarut non-polar.

• Jadi pemisahan campuran senyawa dimungkinkan kalau ada

perbedaan liofilitasnya.
• Senyawa lipofit akan ter-elusi lebih awal dari senyawa hidrofil.
Harjana 2008
 Pemisahan dg KLT
Contoh: pemisahan butyl amine dan cyclohexane secara KLT

Fase gerak / eluen:

Digunakan eluen campuran
• Jika fase gerak non-polar, cyclohexane akan terbawa
oleh eluen, tetapi butyl amine akan tertinggal di fase
diam
• Jika fase gerak polar, cyclohexane dan butyl amine
QuickTime™ and a
keduanya akan terbawa eluen, tetapi dalam perjalanan
TIFF (LZW) decompressor
are needed to see this picture. butyl amine akan berinteraksi dengan fase diam/silica
gel. H2
C
H2C CH2
H2C CH2
C
H2
-
O O
+
+ Si
- H
N
Harjana 2008 H
 Deret eluotropik pelar pengembang
Parafin titik didih tinggi Non-polar ANALIT
Sikloheksan
Benzen Hidrofil
Sikoheksan-etil asetat 95:5
Benzen-etil asetat 95:5
• Asam
Kloroform
Sikloheksan-etil asetat 85:15 • Alkohol
Kloroform-aseton 9:1
Benzen-metanol 95:5 • Amina
Sikloheksan-etil asetat 1:1
 Benzen-etanol 9:1 • Keton
Benzen-etil asetat 1:1
Dietil eter • Eter
Etil asetat-metanol    
Aseton • Hidrokarbon
Dimetil formamid    
Air Daya elusi
 Lipofil

Harjana 2008
Kromatografi
teknik pemisahan fisik campuran komponen dalam suatu sampel, yang
berdasar pada perbedaan migrasi komponen-komponen tersebut dari
fase diam oleh pengaruh fase gerak/mobil

• Kepindahan komponen solute dari fase gerak ke fase diam

– penjerapan (adsorpsi) pada permukaan partikel fase diam
– selang waktu keberadaan linarut di dalam lobang partikel fase
diam
– partisi ke dalam fase diam cair yang melekat pada permukaan
atau dalam lobang medium pendukung
– pembentukan ikatan heteropolar atau ionik dengan fase diam
– desakan fase gerak terhadap linarut (solvophobic)
• Gerak solute dalam fase gerak
– tarikan antar ion - ikatan hidrogen
– interaksi ion-dwikutub (ion-dipole) - pembentukan khelat
– interaksi dwikutub-dwikutub

Harjana 2008
• Penggolongan Metode
KROMATOGRAFI
 
 
Kromatografi gas Supercritical Fluid Kromatografi cair
Chromatography

Gas-cair Gas-padat Kolom Planar Elektroforesis

(partisi) (adsorpsi)
Lapis tipis Kertas

Proses/asas 

Adsorpsi Partisi Solvofobik Size exclusion Pertukaran Afinitas

Inclusion
Chromatography Ion Chromatography
(pemisahan khiral)

 
Filtrasi Permiasi
Gel Gel

Harjana 2008
Harjana 2008
Harjana 2008
Rf = distance spot traveled from origin line/distance of solvent front
(retardation factor)

Solvent Front Line

Distance traveled
by solvent

Distance traveled by spot

Origin Line

Harjana 2008
 Elektroforesis

- +
+ -

Harjana 2008
 ADSORPSI

1. Terjadi adsorpsi semi permanen, proses analisis lama

2. Sistem keseimbangan distribusi tidak ideal
3. Terjadi pengekoran kromatogram / tailing
4. Resolusi kromatogram kurang baik
Harjana 2008
 PARTISI

1. Sistem keseimbangan distribusi ideal

2. Bentuk kromatogram bagus / Gausian peak
• Resolusi kromatogram bagus , memenuhi persyaratan
SST ( System Suitability Test ) Rs = 1 – 1,5 dimana analit
terpisah 98,00 % sampai 99,70 %

Harjana 2008
PERTUKARAN ION

Harjana 2008
 SOLVOPHOBIC

F
a
s
A e
Fase n
a
diam l
i g
t
e
r
a
k

Harjana 2008
 HPLC normal & reverse phase
• Kromatografi fase normal
– Fase diam polar dan fase gerak non-polar
– Analit Lipofil ter-elusi lebih dulu
• Kromatografi fase sungsang (Reverse
phase chromatography)
– Fase diam non-polar dan gerak polar
– Analit Hidrofil ter-elusi lebih dulu

Harjana 2008
SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY (SEC)

Harjana 2008
PEMISAHAN SENYAWA KIRAL
(Inclusion Chromatography/IC)

Harjana 2008
 Kromatogram
S
i
N
6 min (t1)
Y
A
2 min (t0)
l Waktu

• Faktor tambat ini dapat dipakai sebagai parameter analisis kualitatif

– untuk suatu sistem kromatografi kesamaan nilai Rf antara
pembanding dengan analit, baru menyatakan peluang kesamaan
senyawa pembanding dengan analit. (suatu sistem kromatografi
mempunyai peluang benar hanya 50 %)
• Dinamika kromatografi
– Gerakan zona (noda, pita atau puncak) yang disertai dengan
pemisahan zona berbagai linarut.
– Pelebaran zona
– Penurunan kesetangkupan, yang akan menyebabkan terjadinya
ekor
Harjana 2008
 KROMATOGRAM DAN KEGUNAANNYA

Parameter pengukur efisiensi pemisahan dan

kinerja kolom :
 Waktu tambat fase gerak (to)
Waktu tambah analit absolut, dan
waktu tambat relative (tr)
 Faktor kapasitas (k’)
 Selektivitas ()
 Bilangan lempeng teoritis (N)
 Ekivalensi tebal lempeng teoritis (HETP)
 Resolusi (Rs) / Trennzahl TZ
Faktor kesetangkupan puncak vs factor
asimmetri Harjana 2020
 Persamaan migrasi

jarak gerak analit terlarut

Rf =
Jarak gerak pelarut
(retardation factor)

jarak gerak sample

Rx =
jarak gerak Standard Reference Material
(retensi relatif)

tm
Rt =
(waktu tambat) tm + ts

Harjana 2008
 Vr Vr Flow direction

time

Volume void (Vo) & factor kapasitas (K’)

Jika analit A mempunyai K’ = 4, Vo = 1 ml dan laju alir eluen = 1 ml/mnt,

maka total waktu yang diperlukan oleh analit untuk melewati kolom adalah
5 menit ( 1 menit untuk melewati kolom + 4 menit untuk berada/tertambat di
fase diam)
Harjana 2008
 Faktor kapasitas (K’)

4.6 mmID x 250 mmL. (1.2 mL/min)

6 min (t1)
2 min (t0)

4.6 mmID x 250 mmL. (0.6 mL/min)

12 min (t1)
4 min (t0)
►
Harjana 2008
 Faktor kapasitas (K’)

 Waktu tambat tergantung pada laju alir

dan ukuran kolom sehingga tidak dapat dipakai
untuk membandingan dua kromatogram

 Sedangkan factor kapasitas tidak tergantung

pada laju alir dan ukuran kolom

 nilai k’ yang dianjurkan adalah > 2

Harjana 2008
 SELEKTIVITAS, 
Selectivitas adalah
menandakan derajat
keterpisahan 2 puncak
V0
V1 k' 2 V2  V0
Selectivit y  = 
V2 k'1 V1  V0

 Dua analit tidak terpisah jika factor

kapasitasnya sama, atau  = 1
  dapat diatur dengan pemilihan
fase diam dan atau fase gerak
yang tepat
Harjana 2008
 EFISIENSI KROMATOGRAFI

• Suatu kolom/lapis fase diam dapat dipandang

terdiri atas sejumlah lempeng (theoritical plate),
yang pada setiap satu lempeng terjadi
kesetimbangan sempurna antara linarut yang berada
pada fase diam dan fase gerak
• Makin banyak lempeng teoritis makin efisien
• HETP (height equivalent to a theoritical plate), yaitu
panjang atau jarak atau tebal kolom/lapis yang
diperlukan untuk bersifat sebagai lempeng teoritis 
makin tipis HETP makin besar bilangan lempeng
teoritis

Harjana 2008
 JARAK SETARA PELAT TEORI
( High Equivalent of Theoretical Plate / HETP )

HETP

Harjana 2008
 EFISIENSI KOLOM

Krom kolom

N = 5.54 (tr /Wl/2)2

N = 6.28 x (tr x H/Area)2

Makin lebar puncak kromatogram (relatif terhadap

waktu tambat) makin kecil efisiensi elusi kolom.
Neff = 5.54 (t’r /Wl/2)2

Efisiensi kolom biasanya dinyatakan dalam N = bilangan lempeng

teoritis per meter: n X lOO/L, dimana L = panjang kolom (cm). Neff >
30,000 ►
HETP =panjang kolom yang diperlukan untuk satu tahap partisi
Harjana 2008
H = 1/Neff
 THE NUMBER OF
THEORETICAL PLATES, N

 N indicates column efficiency.

N=15000 N=3000

Good efficiency column Bad efficiency column

Harjana 2008
 THE NUMBER OF
THEORETICAL PLATES, N

 The four equations are correct only if the

peak is Gaussian-shaped.
 For asymmetric peaks :
(tR/W0.1)2
N = 41.7 T + 1.25

where W0.1 = peak width at 10% height

and T = tailing factor (T = W/2H)

Harjana 2008
Asal muasal pelebaran pita kromatogram

• Puncak kromatografi mempunyai lebar, berarti molekul -

molekul suatu senyawa memerlukan waktu yang berbeda
untuk melewati kolom, meskipun molekul-molekul ini
mempunyai faktor kapasitas yang sama

Harjana 2008
 Persamaan van Deemter
(pelebaran puncak)

A B
H = + + Csu + Cm/u1/2 (3)
1 + Cm/u1/2 u

A = difusi Eddy B = laju difusi molekul dlm eluen

C = alih masa molekul u = laju alir eluen cm/dt

d2 packing Cs d2 thickness
pendukung Cm = ------------ Salut / Cs = ------------ Cm
Dm bagian aktif Ds
Harjana 2008

 Persamaan Van Deemter pd GC
Pelebaran puncak pada GC dg fase diam pipa kapiler terbuka
lebih lugas dari pada pada LC, karena fase gerak tidak
dimodifikasi oleh fase diam.

F aktor yang berperan pada

B pelebaran pita dalam kolom terbuka

H = A + --- + Cu A = koefisien difusi eddy

B = koefisien difusi analit dlm gas
u u = laju alir gas
C = koefisien alih masa analit gas-
fase diam

Nilai B utk N2 paling kecil, tapi sangat

dipengaruhi u, He tidak dipengaruhi u
C ditekan dgn memperkecil Φ kolom
Harjana 2008
 B
H = A + --- + Cu
H, cm
Kecep optimum u

Minimum peak height

B Daerah C

Daerah A

Kecepatan alir gas, cm/dt

Gambar 2 Hubungan tebal lempeng dan kecepatan alir fase gerak

(McLeod, 1973)

• HETP = Length of Column / N

• Each column have optimum flow rate

Harjana 2008
 Parameter penilaian kinerja kolom

Setelah dilakukan optimasi efisiensi pemisahan maka

selanjutnya mutu kromatografi dikendalikan dengan
menerapkan uji kecocokan sistem (SST, system
suitability tests) dengan menghitung:
(1) bilangan lempeng teoritis N
(2) tampilan kesetangkupan puncak AF
(3) resolusi dua puncak yg kritis Rs
(4) kemurnian puncak, yang dapat dideteksi dengan detektor dua
demensi, misalnya deret dioda atau deret kulometri atau detektor
masa spektrometer MF
(5) reproduciblity waktu tambat puncak RSD / CV

Harjana 2008
 Pemisahan puncak
The quality of a separation is measured by resolution

Memperpanjang jalur berakibat

• alat menjadi panjang, sehingga tidak praktis dan
menimbulkan masalah untuk mengusahakan aliran
yang tetap
• waktu analisis menjadi lama
• makin lama zona bergerak makin melebar zona
sehingga bisa jadi puncaknya makin rendah dan
sampai pada suatu saat tidak terdeteksi

Harjana 2008
Resolusi = derajat keterpisahan antara dua puncak terdekat

2(trB – t rA)
Rs = -----------------
(WbB + WbA)

• Rs = 1 menunjukkan pemisahan dua pucuk puncak

sejauh 4,0, tumpang tindih 2%, bila Rs = 1,5 tumpang
tindih = 0.1 % .

 Harjana 2008

 Selectivity, 
• Only the selectivity can not indicate the
separation performance.

V2
V1
V0

Both of  is the same.

Harjana 2008
 RESOLUTION

 Minimum resolution required for quantitation

is 1.25.
 Baseline separation is achieved when Rs = 1.5.
1:1 1:4 1:16 Peak-height ratio

R = 0.8

R = 1.0

R = 1.25

Harjana 2008
 RESOLUTION
BP
When peaks overlap, determination of base widths
is not easy, so modified equation using peak width at
half-height is used :

(w1)1/2 (w2)1/2 H1/2

H

v2-v1
Rs = 1.18
(w1)1/2 +(w2)1/2
Harjana 2008
 RESOLUTION

   1   k' 
1
R  4
  
  
N 
 k '1

N : average of N1 and N2
k' : average of k'1 and k'2

Harjana 2008
 RESOLUTION

is a function of
Partition coefficient
Selectivity
Column Efficiency
Capacity factor

Harjana 2008
RESOLUTION

Harjana 2008
 RESOLUTION

Initial
Use a longer column or
better performance column.
increase N
Decrease an organic solvent
content for ODS column.
increase k*
Change organic content,
pH, sort of organic solvent,
change  column temperature.

Harjana 2008
 RESOLUTION

 Improvement in resolution can also be achieved

by adjusting the flow rate for optimum level;

 Or by adjusting temperature but increase in

temperature leads to shorter column lifetime.

Harjana 2008
Hubungannya dengan
bilangan lempeng teoritis
adalah :
R s = N1/2 (1 -  )
z
N1/2 =
4  (1 -  )

Harjana 2008
 Puncak asimetri
Asymmetry factor (AF) = b/a
Lebar a dan b diukur pada ketinggian 10%
dari baseline

A Time (min) B Time (min)

AF = 0,97 AF = 1.77
Penyebab asimetri :
1. suntikan sample ke dalam kolom terlalu besar/banyak,
2. peruraian sample,
3. analit terlalu kuat terjerap (adsorbsi) oleh bagian aktif fase
diam,
4. banyak jebakan dan dead volume dalam sistem kromatografi
Harjana 2008
 Recommended System Suitability Testing
Acceptance Criteria for Chromatogram
Parameter Assay Type Acceptance criterion
Capacity Factor General 2-8
Trace 1-3
Selectivity General 1.05 - 2.00
Retention Time
General < 0.1 min
Variation
Resolution General > 2.0
Quantitative > 1.5
Biological > 1.2
Plate Count General > 2000
Precision (n=5) General %RSD< 1.5%
Biologicals %RSD< 5%
Trace %RSD 5-15%
Symmetri General 1.5 - 2
Harjana 2008
 Kromatogram dan laporan SST

n per W1l2
Retention
Component Area % column AF min Rs K'
time
A 20.1 16.3 50166 0.96 0.2 18.3
B 20.8 13.2 65229 0.87 0.2 1.4 18.9
C 21.2 15.5 81189 1.13 0.17 0.81 19.2
D 22.0 2.21 44 397 0.99 0.23 1.8 20.0
IS 25.7 37.9 64316 0.75 0.23 - 23.4

Harjana 2008