KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

(KCKT)
HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY (HPLC)
 What does HPLC mean?

• High pressure liquid chromatography

• High priced liquid chromatography
• Hewlett-Packard liquid chromatography
• High performance liquid chromatography
• Hocus pocus liquid chromatography
• High patience liquid chromatography
High pressure liquid
chromatography is abbreviated as
HPLC. But with its efficiency it is High
performance liquid
chromatography
 APPLICATIONS OF HPLC

• Environmental
• Veterinary
• Agriculture &
• Food
• Chemistry
• Biomedical and Clinical
HPLC applications include
 detection,
 analysis,
 determination,
 quantification,
derivation of molecules from mixtures (prep.
hplc) of biological, plant, medical importance.
• HPLC theory: The principle involved in HPLC
testing is separation of compounds in a
mixture more efficiently and also quickly than
that of traditional column chromatography.
Kromatografi cair kinerja tinggi pada dasarnya
merupakan bentuk perbaikan kromatografi
kolom. Dimana awalnya pelarut yang mengalir
melalui kolom karena gravitasi, kini dipaksa
melalui di bawah tekanan tinggi (> 400
atmosfer) yang membuatnya jauh lebih cepat.
Hal ini juga memungkinkan untuk menggunakan
ukuran partikel yang sangat kecil untuk bahan
pengemasan kolom yang akan memberikan area
permukaan yang jauh lebih besar untuk interaksi
antara fase diam dan molekul yang mengalir
melewatinya. Sehingga pemisahan komponen-
komponen campuran yang jauh lebih baik.
Pada KCKT diperkenalkan penggunaan fase diam
yang berdiameter kecil dalam kolom yang efisien.
Teknologi kolom partikel kecil (3-5 μm) ini
memerlukan sistem pompa bertekanan tinggi yang
mampu mengalirkan fase gerak dengan tekanan
tinggi agar tercapai laju aliran 1-2 mL/menit. Oleh
karena sampel yang digunakan sangat kecil (< 20
μg) maka diperlukan detector yang sangat peka.
Dengan teknoloi ini, pemisahan berlangsung
sangat cepat dengan daya pisah sangat tinggi
 Keuntungan KCKT
 Metode HPLC mengevaluasi hampir semua molekul dari golongan
yang sama. Sebagai contoh dalam satu kali jalan (single run) semua
mono-amina seperti dopamine, epinefrin, serotonin dapat
diperkirakan. Menjalankan steroid tunggal memberikan data untuk
semua steroid.
 Molekul dengan perbedaan panjang gelombang absorpsi yang kecil
dapat dideteksi dengan baik karena perbedaan waktu pemisahan.
 Zat dalam konsentrasi yang sangat rendah seperti nano dan
pikogram dapat dideteksi dengan sensitivitas detektor HPLC yang
digunakan.
 Kualitas zat yang diperoleh dengan teknik preparatif (persiapan
hplc) adalah kemurnian tinggi.
 Kekurangan KCKT
 Teknik yang mahal karena membutuhkan instrumentasi HPLC
yang mahal, kolom dan juga penggunaan kemurnian kelas
tertinggi dari pelarut, buffer, dll.
 HPLC memerlukan pemrosesan yang berat sebelum estimasi
seperti filtrasi, degassing, derivatisasi, dll.
 Sistem operasi membutuhkan pelatihan dan
keterampilan pemecahan masalah yang bisa terjadi.
 Data yang diperoleh adalah non-homogen dan tidak pernah
tanpa ganggunan suara (fluktuasi) dan kesalahan selama
estimasi.
 Semuanya memakan waktu.
 Sistem dan Instrumen KCKT

Sistem KCKT terdiri dari dua sub sistem yaitu sub

sistem pemisahan dan sub sistem pendeteksian
(detektor). Sistem pemisahan terdiri dari
beberapa modul yaitu sistem pemasok pelarut
dengan bagian utamanya pompa yang
mengalirkan pelarut sampel (yang
diinjeksikan dan melalui kedalam
Sistem pendeteksian
injektor) terdiri dari detektorkolom.
yang dihubungkan pada ujung akhir kolom.
A flow scheme for HPLC
 KOTAK HITAM KROMATOGRAFI

VARIABEL TERKONTROL

Fase Gerak Selektifitas

 Komposisi
 Laju Alir
Kolom Suhu Kepekaan

KROMATOGRAM
SAMPEL Pemisahan Pencirian

Kromatograf APLIKASI :
1. Identifikasi
2.Kemurnian
3.Penetapan Kadar

Kinerja Stabilitas Noise Drift

Aliran
Kolom
VARIABEL TIDAK TERKONTOL
 Aspek Praktis Teori Kolom

Teori kolom dapat digunakan sebagai petunjuk dalam

mendesain pengoperasian KCKT.
Dengan teori ini dapat dioptimasi antara resolusi,
kecepatan analisis dan jumlah sampel yang dianalisis.
Upaya optimasi hasil analisis ternyata dapat diperoleh
secara empirik hanya dengan mengubah-ubah salah
satu parameter analisis pada saat melakukan
percobaan.
Kondisi dan parameter percobaan diubah-ubah sampai
akhirnya diperoleh pemisahan yang baik dalam waktu
relatif singkat sehingga jumlah sampel yang dianalisis
meningkat.
1. Waktu retensi (tR)

Waktu yang dibutuhkan setelah penyuntikan

sample untuk memunculkan suatu puncak
analit oleh detektor disebut waktu retensi
dan diberi simbol tR.
Puncak kecil yang muncul disebelah kiri
merupakan puncak spesi yang tidak ditahan
oleh kolom. Seringkali sampel atau fase
gerak mengandung spesi yang tidak ditahan
kolom, kalau mereka tidak mengandung
spesi tersebut kadang-kadang perlu
ditambahkan untuk mengidentifikasi puncak.
Waktu yang tidak diretensi (tM) disebut juga
sebagai waktu mati (dead time).

Laju migrasi spesi yang tidak ditahan sama

dengan laju rata-rata migrasi molekul fase
gerak dalam kolom.
2. Faktor kapasitas (k’)

Faktor kapasitas merupakan parameter penting

yang dapat digunakan menjelaskan laju
untuk analit dalam kolom. Untuk spesi A,
migrasi
faktor kapasitas k’A didefinisikan sebagai berikut :
t -t V -
k'A  VRt M  RA
V
M
M M

Dimana tR merupakan waktu yang diretensi

tM waktu yang tidak diretensi oleh spesi A.
VRA adalah volume retensi spesi A
VM volume fase gerak.
Jika faktor kapasitas suatu spesi kurang dari satu maka
elusinya sangat cepat berlangsung artinya spesi tersebut
ditahan sedikit oleh kolom dan terelusi dekat puncak
spesi yang tidak diretensi. Ini menunjukkan pemisahan
yang jelek dan waktu retensi sulit diukur dengan cermat.
Jika faktor kapasitas berkisar antara 20 sampai 30,
waktu elusinya sangat lama dan kurang berarti untk
analisis.
Faktor kapasitas antara 2 sampai 10 menunjukkan
pemisahan yang baik. Beberapa pustaka
merekomendasikan faktor kapasitas yang baik adalah
1<k’<10.
 3. Faktor selektifitas (α)

Faktor selektifitas (α) dari suatu kolom

untuk spesi A dan B didefinisikan sebagai
berikut : K k' (t ) -
α 
t B B R B M
K k' (t ) -
A A RA M
t
dimana KB adalah koefisien partisi spesi B yang lebih
kuat diretensi oleh kolom
KA adalah koefisien partisi spesi A yang lemah
diretensi kolom.
Dengan demikian α selalu lebih besar dari
satu (α>1) dan dapat dihitung dari kromatogram.
4. Efisiensi kolom (N)

Efisiensi kolom sebagai jumlah

didefinisikan teoritik dihitung
lempeng yang dapat sebagai
berikut : L
N 
H
Dimana L adalah panjang kolom
H adalah tinggi lempeng teoritik yang efektif
(HETP/ High Effective Teoritic Plate).

Dengan demikian efisiensi kolom akan meningkat

dengan semakin panjang kolom (L) dan semakin
kecil harga H.
Secara empirik harga N dapat dihitung
dari kromatogram sebagai berikut :
2
R
N  16  t 
 W 
dimana W adalah lebar puncak.
Kolom yang efisien dapat mencegah pelebaran
pita sehingga menghasilkan pita yang sangat
sempit.
5. Resolusi (R)

Resolusi dari suatu kolom adalah

(R) ukurankemampuan kolom untuk
memisahkan dua analit. Resolusi
disefinisikan sebagai berikut :

2 t RB
R
WB  W A
- t RA 
Dimana tRB dan tRA adalah waktu retensi
spesi B dan A,
WB dan WA adalah lebar alas puncak
spesi B dan A.
Persamaan tersebut dapat dihitung langsung
dari kromatogram, jika puncak A dan B terpisah
secara sempurna. Satuan antara t dan W harus
sama yaitu dalam satuan menit atau satuan
volume (mL). Harga R ≥ 1,5 menunjukkan
puncak A dan B terpisah dengan sempurna.
Kadangkala lebar alas puncak sulit diukur,
apalagi kalau kedua puncak kromatogramnya
tumpang tindih.
Hubungan matematik untuk meneliti kinerja
suatu kolom antara resolusi (R),
kapasitas (k’), faktor selektifitas (α) dan jumlah
faktor
lempeng (N).
 k' 
R  0,25 α - 1 N 0,5

 1  k'

N  16 R 2 2 1   1  k'  


 α - 1   
k'
10
α - 1
 N 0,5
dengan memperhitungkan k’=2 dan R=1,5
 Skema instrument KCKT

Tekanan POMPA Laju alir: 0-3 mL/menit

500-6000 psi
Fase gerak PELARUT Ragam: Isokratik
disaring dan gradient
diawagaskan

Suntikan sampel
(10-50 μL)
Fase diam: KOLOM Panjang: < 250 mm
Normal: silika Diameter: 5 mm
Terbalik: ODS-OS
* Ultraviolet- DETEKTOR INTEGRATOR
tampak
* Indeks bias
* Fluorosensi
* Elektrokimia KOLEKSI LIMBAH

KCKT PREPARATIF
1. Pompa

Sistem pompa bertekanan tinggi mengalirkan pelarut / fase gerak

dari bejana pelarut ke kolom melalui pipa tekanan tinggi.
Beberapa jenis pompa dapat digunakan untuk KCKT asal dapat
memberikan tekanan dan pendesakan pelarut secara merata,
tetap dan sinambung. Jenis pompa yang dipakai antara lain
pompa pneumatik, pompa pendesakan tetap dan pompa torak
dengan pendesakan bolak-balik (paling banyak digunakan). Laju
aliran pelarut dalam kolom pada umumnya sekitar 1-3 mL/menit
dengan tekanan berkisar antara 500-6000 psi. Teknik elusi KCKT
dapat dilakukan secara isokratik (komposisi pelarut tetap selama
elusi) dan elusi landai (gradient, komposisi pelarut berubah
selama elusi)
2. Sistem injektor sampel

Penyuntikan sampel ke dalam kolom sering menjadi masalah

karena adanya tekanan balik yang cukup tinggi. Pada awalnya
sampel diinjeksikan langsung kedalam aliran pelarut dalam kolom
dengan semprit mikro melalui septum injektor menggunakan
diafragma atau tanpa diafragma. Sekarang yang lebih banyak
dipakai adalah sistem suntik katup kitar (loop valve). Katup ini tidak
memutuskan aliran selama proses penyuntikan dan meningkatkan
kecermatan. Katup ini pun memberikan volume suntik yang tepat
walaupun ada tekanan balik dan tidak memerukan lagi semprit
mikro. Volume suntik biasanya 10-50 μL dengan keterulangan
0,1%.
3. Kolom

Kolom KCKT pada umumnya terbuat dari pipa baja tahan karat.
Panjang kolom antara 10-30 cm dengan diameter dalam 4,5-5,0
mm. Kolom diisi dengan kemasan yang sesuai diperlukan untuk
pemisahan tertentu. Dikenal dua jenis kolom yaitu kolom preparatif
dan kolom analitik. Kolom yang digunakan untuk pemisahan analitik
umumnya mempunyai diameter dalam yang kecil (2-4 mm). Kolom
dapat dipanaskan sampai 60oC agar dihasilkan pemisahan yang
lebih efisien. Jika tidak dinyatakan lain, kolom dipertahankan pada
suhu kamar. Ujung-ujung kolom dihubungkan dengan pipa baja
tahan karat atau pipa lainnya melalui fiting dan terminator dari
pompa/injektor di ujung yang satu dan pada ujung yang lain
dihubungkan dengan detektor. Arah pengaliran fase gerak harus
selalu sama. Mengingat pengemasan sendiri sangat sulit dan juga
bahan fase diamnya mahal, maka biasanya kolom KCKT tidak
disiapkan sendiri melainkan dibeli dari produsen tertentu.
4. Detektor

Detektor dihubungkan dengan pipa baja tahan karat atau pipa

jenis lainnya dengan ujung keluaran kolom. Detektor memantau
aliran pelarut yang keluar dari kolom dalam waktu yang
sebenarnya. Jenis detektor yang dipakai untuk deteksi adalah
detektor indeks bias, ultraviolet sinar tampak, fluoresensi,
elektrokimia dan spektrometri massa. Pada umumnya, respon
yang berasal dari detektor diperkuat dahulu sebelum disampaikan
pada alat perekam otomatis. Dapat pula respon ini dikirimkan
kesuatu integrator digital elektronik untuk mengukur luas puncak
kromatogram secara otomatik.
Pengembangan Metode Analisis

Tujuan pengembangan adalah untuk memperoleh suatu metode

yang sesuai memenuhi syarat, cermat dan seksama, resolusi dan
selektivitas tinggi, cepat, sensitif dan reprodisibel.

Langkah-langkah yang ditempuh adalah:

1. Pengumpulan informasi
Informasi yang penting itu mencakup jenis komponen yang akan
dianalisis termasuk sifat-sifat fisikokimianya yaitu: struktur
molekul, bobot molekul, keasaman dan kebasaan, spektra UV,
rentang kadar, data kelarutan dan matriksnya (bentuk sediaan,
pengisi dan cairan biologi, dll)
Pertanyaan dibawah ini sering digunakan untuk memandu kita dalam
mencari data pustaka:

a. Apakah identitas komponen sudah diketahui?

b. Apakah senyawa pembanding kimianya sudah diketahui?
c. Berapa kadar komponen itu dalam sampel?
d. Berapa banyak sampel yang harus dianalisis?
e. Berapa tingkat kecermatan dan keseksamaan analisis
yang harus dipenuhi?
f. Adakah metode yang mirip dengan pustaka?
g. Apakah semua sarana dan prasarana analisis sudah
siap tersedia? (termasuk atriks simulasi?)
Setelah informasi diperoleh kita perlu menyusun rencana strategi
(jangka pendek) analisis secara tertulis.

Untuk KCKT tiga sifat fisikokimia yang penting yang harus diketahui
dari sampel yaitu : bentuk sampel, bobot molekul dan kelarutannya.
Disamping itu kita harus sudah yakin bahwa analit yang ada dalam
sampel dapat dideteksi dengan detektor yang ada.
Pada umumnya sampel yang akan dianalisis berbentuk:

a. Larutan yang siap diinjeksikan

b. Larutan yang memerlukan pengenceran, pendaparan
atau penambahan cairan yang lainnya
c. Larutan yang mengandung bahan asing dan “perusak
kolom” yang harus dihilangkan dengan cara ekstraksi
cair- cair atau padat cair
d. Zat padat yang larut air atau fase gerak yang digunakan
e. Campuran berbagai bahan dalam suatu matriks
tertentu, dalam hal ini analit harus diisolasi dengan cara
ekstraksi
Tiga bentuk sampel yang terakhir perlu dilakukan “prae treatment”
agar diperoleh larutan analit yang siap diinjeksikan ke dalam
kromatograf. Dalam tahap ini sudah dipikirkan apakah perlu metode
baku internal atau baku tinambah agar kecermatan dan
kesaksamaan analisis dapat dicapai dengan baik.
2. Pemilihan detektor

Detektor adalah suatu instrumen yang dihubungkan pada ujung akhir

suatu kolom yang berfungsi memantau analit yang dipisahkan kolom.
Beberapa persyaratan yang harus dipertimbangkan dalam memilih
detektor adalah : linier antara respon dengan konsentrasi, kepekaan
tinggi, ketepatulangan, volume mati sel serendah ungkin dan mudah
perawatannya.

Pilihan pertama detektor ditujukan pada detektor UV panjang

gelombang tertentu, misalnya 254 nm. Ini dipilih karena banyak
senyawa yang menyerap radiasi pada panjang gelombang ini. Jika
detektor ini tidak memadai maka pilihan berikutnya pada detektor
panjang gelombang beragam (multiple wavelength). Panjang
gelombang pengukuran dipilih berdasarkan serapan maksimum dan
absorptivitas molar (ε) analit yang akan dianalisis.
3. Pemilihan kolom

Kolom pada KCKT merupakan faktor yang sangat menentukan karena

didalam kolomlah pemisahan berlangsung. Kolom yang baik harus
memberikan resolusi yang baik dengan waktu pemisahan yang tidak
lama (<20 menit). Kolom KCKT berupa pipa baja tahan karat, gelas
atau plastic yang berisi fase diam. Fase diam dapat berupa zat padat
(pada kromatografi adsorpsi) atau berupa zat cair yang disaput pada
partikel silika berpori, tetapi sekarang berupa fase terikat secara kimia
pada suatu penyangga (paka kromatografi partisi)
Kolom HPLC

Injector
Untuk mengikat fase diam pada penyangga silika secara kimia telah
digunakan tiga cara dasar. Semuanya melibatkan reaksi dengan
gugus silanol (-Si OH) yang reaktif pada permukaan silika. Reaksi
pertama berdasarkan reaksi eterisasi, reaksi kedua berdasarkan
reaksi silisasi dan yang ketiga berdasarkan reaksi alkilasi Grignard.
Pada dasarnya sejumlah besar gugus fungsi dapat diikat oleh gugus
silanol penyangga. Tapi gugus yang paling umum dipakai adalah oktil,
oktadekil, fenil, alkilamina dan alkil nitril.
4. Pemilihan fase gerak

Fase gerak memegang peranan penting dalam pemisahan analit

karena migrasi analit diatur oleh interaksi fase gerak dan fase diam.
Migrasi analit terjasi karena adanya kompetisi antara fase gerak dan
analit untuk dapat terikat pada sisi-sisi aktif dari fase diam. Fase gerak
yang dipakai biasanya merupakan campuran 2 atau lebih pelarut yang
kekuatannya berbeda.

Pelarut yang kepolarannya berbeda jauh dengan kepolaran fase

diam dianggap sebagai pelarut yang lemah, karena pelarut jenis ini
tidak akan ditahan kuat oleh fase diam dan belum tentu dapat
mengusir analit dari ikatannya dengan fase diam untuk bermigrasi.
Pelarut jenis ini mempunyai kepolaran yang tidak berbeda jauh
dengan fase diam.
Sifat fisika-kimia pelarut yang harus diperhatikan untuk memilih pelarut
yang dipakai dalam KCKT adalah viskositas, kompresibilitas, indeks
bias, tekanan uap, titik leleh, spektrum UV, nilai ambang batas, daya
campur dan kepolaran.

Disamping itu pelarut yang dipakai dalam KCKT harus murni secara
kimia, bebas partikel, bebas dari gas terlarut, dicampur dengan benar
dan taat asas.
5. Penentuan kondisi dan kesesuaian sistem

Bila memakai KCKT pada umumnya dkehendaki adanya kepastian

kesesuaian dan kondisi percobaan yang dilakukan. Penentuan ini
disebabkan karena adanya pengaruh kondisi yang disebabkan jenis
peralatan sistem elektronik, zat uji dan kualita pereaksi yang
digunakan terhadap hasil analisis.

Kondisi percobaan yang harus ditetapkan meliputi: laju aliran pelarut,

suhu kolom, kecepatan kertas perekam, attenuation dan nilai ambang
yang digunakan (tinggi puncak, luas, lebar kromatogram). Untuk KCKT
perlu ditetapkan juga keberulangan dari penyuntikan, waktu retensi,
faktor ikutan, dll, sesuai dengan uji kesesuaian sistem yang tertera
dalam Farmakope.
Kriteria penentuan kondisi percobaan dan kesesuaian
sistem

Parameter Percobaan Kriteria

1. Keberulangan penyuntikan Koefisien variasi < 2%
2. Laju aliran 1-2 mL/menit
3. Tekanan 100 – 200 bar
4. Waktu pemisahan 10 – 20 menit
5. Faktor kapasitas 1<k’<10
6. Faktor selektivitas α>1
7. Faktor ikutan / simetris
8. Kromatogram Tf=1
9. Resolusi Lanci
10. Penggunaan pelarut p,
11. Efisiensi kolom tajam
tidak
mele
bar
dan
tak
bere
kor
R≥1
Kromatografi merupakan teknik pemisahan
yang mana senyawa kimia/obat terpisah oleh
perbedaan kecepatan elusi yang dikarenakan
oleh senyawa ini melewati kolom kromatografi

Solut atau analit adalah senyawa obat yang

dianalisis
Pemisahan solut-solut diatur oleh distribusi
solut dalam fase gerak dan fase diam.
 Komponen-komponen utama pada KCKT
1. Wadah fase gerak
2. Pompa untuk mengalirkan fase gerak
3. Alat untuk memasukkan sampel
4. Kolom
5. Detektor
6. Wadah penampung buangan fase gerak
7. Tabung penghubung
8. Komputer/integrator untuk mengolah
data sinyal sehingga diperoleh suatu
kromatogram
1. Wadah fase gerak
merupakan untuk menampung fase gerak
yang digunakan selama proses pemisahan
dengan KCKT. Wadah ini harus bersih dan
lembam (inert) atau tidak bereaksi dengan
komponen fase gerak. Wadah bisa berupa
wadah pelarut kosong atau labu
laboratorium.
2. Fase gerak
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas
campuran pelarut yang dapat bercampur dan
secara keseluruhan berperan dalam daya
elusi dan resolusi. Daya ini ditentukan oleh
polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase
diam, dan sifat komponen-komponen
sampel.
Fase gerak harus berinteraksi dengan
diam yang sesuai fase untuk memisahkan
campuran obat secepat dan
senyawa mungkin.
seefisien
Kriteria pemilihan fase gerak
1. Viskositas
pelarut dengan rendah
menghasilkan tekananyang lebih rendah
viskosias
dibandingkan pelarut dengan viskositas tinggi
pada suatu kecepatan alir tertentu. Viskositas
rendah juga memungkinkan kromatografi
yang lebih cepat karena perpindahan masa
berlangsung lebih cepat.
2. Transparansi terhadap uv
jika detektor uv yang digunakan maka fase
gerak harus transparan secara sempurna pada
panjang gelombang yang digunakan.
Transparansi garam-garam buffer, reagen-
reagen pasangan iondan bahan tambahan lain
juga harus diperhatikan.
3. Indeks bias
penting jika detektor indeks bias yang
digunakan. Perbedaan indeks bias
pelarut dengan sampel harus besarantar
jika bekerja dengan batas-batas deteksi a
tertentu.
4. Titik didih
titik didih fase gerak yang rendah diperlukan
jika eluat akan dilakukan pemprosesan lebih
lanjut supaya memudahkan dalam
penguapannya. Di satu sisi pelarut dengan
tekanan uap tinggi (TD tinggi) pada suhu
kamar cendrung menghasilkan gelembung-
gelembung uap dalam detektor.
5. Kemurnian
tidak adanya senyawa yang mengganggu pada
bentuk deteksi yang digunakan, tidak
adanya yang mengganggu elusi gradien
senyawa
(berguna untuk
campura meningkatkan yangterutamresolusi jika
sampel
n mempunyai
kompleks a
luas),
kisarantidak adanya residu non-volatile
polaritas yang
dalam kasus pemisahan preparatif.
6. Lembam (inert) terkait dengan senyawa-
senyawa sampel
fase gerak harus tidak bereaksi sama sekali
dengan campuran sampel. Jika sampel yang
sianalisis sangat peka terhadap oksidasi maka
fase gerak dapat ditambah senyawa
antioksidan.
7. Toksisitas
seorang analis menghindari
harus
penggunaan produk yang toksik
semaksimal Pelarut
mungkin. terklorinasi dapat
melepaskan gas yang
Toluen
fosfen harus menggantikansangatbenzenatoksik.
bersifat karsinogenik, kapanpun
yang
dimungkinkan.
8. Harga

Fase gerak yang paling sering digunakan untuk

pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran
larutan buffer dengan metanol atau campuran air
dengan asetonitril.
Untuk fase normal fase gerak yang sering
digunakan adalah campuran pelarut hidrokarbon
dengan pelarut yang terklorisasi atau
menggunakan pelarut jenis alkohol.
3. Pompa pada KCKT
syarat pompa adalah inert terhadap fase gerak.
Bahan yang umum dipakai pada pompa adalah
gelas, baja tahan karat, teflon dan batu nilam.
Pompa yang baik mampu memberikan tekanan
sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase
gerak dengan kecepatan alir 3 ml/menit. Untuk
tujuan preparatif pompa yang digunakan harus
mampu mengalirkan fase gerak dengan
kecepatan 20 ml/menit
Tujuan penggunaan pompa atau sistem
penghantaran fase gerak
menjamin proses penghantaran adalah
fase untuk
berlangsung secara tepat,
reprodusibel, konstan dan bebas dari gerak
gangguan.
4. Alat untuk memasukkan sampel
Sampel cair dan laruan disuntikkan
secara langsung kedalam fase
gerak
dibawah yang mengalir menuju
tekanan kolo
m menggunakan alat penyuntik yang
dari tembaga ahan karat dan katup teflon
terbuat
yang dilengkapi dengan keluk sampel internal
atau eksternal