KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

DOSEN : OKTA FERA M.Farm, Apt

HPLC/KCKT
(High Performance Liquid
Chromatography/
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi )
 HPLC/KCKT
(High Performace Liquid Chromatography/
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi)

• Adalah suatu metoda analisa kuantitatif dan

 Untuk KCKT sendiri pemisahan didasarkan
atas perbedaan sifat kepolarannya. Sebetulnya • Prinsip dasar dari KCKT yakni memisahkan
hanya ada dua hal utama yang menjadi krusial
point dalam metode KCKT. :
1. proses separasi/pemisahan
2. proses identifikasi.
Dua hal ini mejadi faktor yang sangat penting
dalam keberhasilan proses analisa.
kualitatif dengan memisahkan suatu senyawa
menggunakan fase gerak berupa cairan yang
dialirkan dengan tekanan tinggi melalui kolom
sebagai fase diamnya
setiap komponen dalam sample untuk
selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan
dihitung berapa konsentrasi dari masing-
masing komponen tersebut (kuantitatif).
 Prinsip Kerja KCKT
Suatu fase gerak cair dipompa dibawah tekanan
melalui kolom baja yang mengandung partikel-
partikel fase diam dengan diameter 3-10 um.
Analit tersebut dimasukkan ke dalam bagian atas
kolom melalui katup lengkung dan pemisahan suatu
campuran berlangsung sesuai dengan lamanya
waktu relatif yang dibutuhkan oleh komponennya di
dalam fase diam.
Perlu diperhatikan bahwa semua komponen di dalam
campuran membutuhkan waktu yang kurang lebih
sama dengan fase gerak agar dapat keluar dari
kolom. Pemantauan eluen kolom dapat dilakukan
dengan berbagai detektor.
 Jenis-jenis HPLC
Kromatografi Padat-cair
Kromatografi Penukar Ion
Teknik ini tergantung pada
Kckt penukar ion menggunakan fase
teradsorpsinya zat padat pada
diam yang dapat menukar kation atau
adsorben yang polar seperti silika gel
anion dengan suatu fase gerak.
atau alumina
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion
Teknik ini biasanya digunakan untuk zat
padat yang mudah larut dalam pelarut
organik dan tidak terionisasi.
A PI dilakukan dengan menggunakan media
air karena sifat ionisasinya .

Kromatografi Eksklusi
Kromatografi Partisi Pemisahan didasarkan pada ukuran
Teknik ini tergantung pada partisi zat
molekul dari zat padat. Pengepaknya
padat diantara 2 pelarut yang tidak dapat
merupakan suatu gel dengan
bercampur salah satu diantaranya
permukaan berlubang-lubang sangat
bertindak sebagai fasa diam dan yang
kecil yang inert. Molekul-rnolekul kecil
lainnya sebagai fasa gerak.
Kromatografi partisi disebut "fase
normal" bila fase diam lebih polar dari
P E dapat masuk dalarn jaringan dan
ditahan dalam fase gerak yang
menggenang. Molekul yang lebih besar,
fase gerak dan "fase terbalik" bila fase
tidak dapat masuk kedalam jaringan
gerak lebih polar dari pada fase diam.
dan lewat melalui kolom tanpa ditahan.
.
Semakin polar suatu fase gerak, semakin cepat fase tersebut akan mengelusi senyawa dari kolom
silika gel, dan semakin lipofilik suatu fase gerak, semakin cepat fase tersebut akan mengelusi
senyawa dari kolom fase-balik.

Fase gerak dan

fase diam

Faktor-faktor struktural Pertimbangan lebih Pertimbangan lebih

yang mengatur laju elusi lanjut terhadap lanjut terhadap fase
senyawa dari kolom selektivitas pelarut diam fase balik
KCKT dalam kromatografi fase
• Elusi senyawa netral balik
• Pengendalian laju elusi
senyawa-senyawa yang
dapat terionisasi melalui
penyesuaian pH fase
gerak
 INSTRUMENT HPLC

detektor

kolom
injektor
oven
pompa

Wadah
solven
WADAH FASE GERAK
Untuk menampung fase gerak yang digunakan selama proses
pemisahan/analisis dengan KCKT. Wadah ini harus bersih dan
lembam (inert). Bahan yang umum digunakan adalah gelas dan baja
anti karat. Biasanya bisa menampung 1-2 L fasa gerak.
 Kriteria pemilihan Fase Gerak

Toksisitas
Viskositas

Indeks Bias

Transparansi
Harga
Terhadap UV Lembam
(inert)
Syarat-syarat fase gerak pada sistem KCKT

Harus murni secara kimia

Harus bebas dari gas

Harus bebas dari partikel-partikel kecil

Tidak bereaksi dengan pengamas kolom

(inert)

Dapat melarutkan sampel dengan baik

Viskositas rendah
 POMPA
Pompa adalah salah satu bagian yang sangat penting dalam semua sistem KCKT.
Bermacam-macam jenis atau tipe pompa telah digunakan dalam percobaan KCKT.
Ada dua kelas sistem alat pemompa yang digunakan,
 Sistem pompa penghantaran tekanan konstan
 Sistem pompa aliran fase gerak yang konstan.
 INJEKTOR: Alat untuk pemasukan sampel ke dalam sistem KCKT

Sistem Injektor:
 Stop flow
Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran
dilanjutkan lagi.
 Septum
Injector septum merukapan injector langsung pada aliran, dapat dipakai pada tekanan 60-70
atm, tetapi tidak dapat dipakai untuk pelarut kromatografi cair.
 Katup putaran
Tipe injector ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih dari 10 µl dan dilakukan
dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil
dapat diinjeksikan secara manual).
 Autoinjektor
Untuk skala perusahaan/industri.
Sejumlah volume sample (dalam solvent) disuntikkan ke dalam loop dalam posisi “load”, sampel
masih berada di dalam loop
Kran diputar (ke bawah) utk mengubah ke posisi “injeksi” dan fasa gerak membawa sample ke
dalam kolom
OVEN KOLOM – instrumen pemanas

Kolom Analitik Kolom Preparatif

Diameter dalam 2 -6 mm. Umumnya memiliki

Panjang kolom tergantung diameter 6 mm atau lebih
pada jenis material pengisi besar dan panjang kolom 25
kolom -100 cm.
 Tipe-Tipe Kolom HPLC

CONVENTIONAL
MICROFEEDER PUMP
COLUMN

Mikro Column
HPLC Pump Makro Column

Small Bore Packed Packed Capillary Open tubular

Colomn Column kolumn
 Id (Inner Flow Rate Sample
Tipe kolom Lenght
Diameter) (Mobile Phase) Capsity

Conventional
4,6 mm 10-25 cm 1 mL/min 10-100µg
Column

Small Bore
0,2-1 mm 1-10 cm 1-20µL/min 1-10µg
Packed Column

Packed capillary
40-80µm 1-100 cm 0,5-2µL/min 1µg-100 ng
Column

Open Tubular
15-10µm 1-100 cm ˂ 1µL/min ˂100 ng
Column
DETEKTOR HPLC
DETEKTOR
yang biasanya berupa detektor UV/visibel, meskipun untuk
penerapan khusus tersedia berbagai macam detektor.

PROSESOR
Yang dapat berupa suatu integrator komputasi atau sebuah
komputer dengan piranti lunak yang sesuai untuk memproses data
kromatografi.
 DETEKTOR PADA HPLC
Syarat Detektor Yang Baik :

 Stabil dalam pengoperasiannya

 Mempunyai respon cepat terhadap solut dan reprodusibel
 Sensisitivitas tinggi
 Memiliki sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.
 Antara sinal yang dihasilkan dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas,
berbanding lurus.
 Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
 Respons Universal dan dapat diaplikasikan untuk semua analit
 Mudah digunakan dan dapat dipercaya
 Tidak merusak sampel
 Tidak mahal (harga, biaya operasi, dan perawatan)
 7 Macam Detektor

Detektor
Detektor Detektor
elektrokimia
hamburan-cahaya amperometik
evaporatif berpulsa

Detektor dioda Detektor indeks

array (DAD) bias
Macam-macam
Detektor yang
digunakan
Detektor UV
Detektor
panjang
fluoresensi
gelombang
yang bervariasi
 Detektor UV
 Detektor yang didasarkan pada adanya
peneyerapan radiasi UV dan sinar tampak
 Detektor ini bekerja pada λ tertentu dimana
pelarut tidak menyerap sinar pada λ tersebut
sedangkan cuplikan menyerap dengan kuat.
 Ada dua jenis detektor UV : detektor dengan
satu panjang gelombang (254 nm) dan
detektor dengan λ yg dapat diubah ubah
antara 200-700 nm
 Detektor mempunyai jangka kepekaan yg
lebar
 Detektor ini hanya bekerja jika senyawa
mempunyai kromofor
Detektor PDA
 Mampu memberikan kumpulan
kromatogram secara simultan pada
panjang gelombang yg berbeda dlm
sekali proses (single run)
 Pada kromatogram dapat pula
ditampilkan spektrum UV shg dpt
digunakan untuk memilih λmaks
utk sistem HPLC
 Spektrum dan kromatogram yang
dihasilkan ditampilkan sbg plot 3
dimensi (absorbansi, panjang
gelombang, dan waktu)
Detektor Photodiode Array : Kromatogram 3D
Spektrum
kromatogram
Absorbansi

.
lb
ge
g
an
nj
Pa
waktu
 Detektor Indeks Bias

Detektor indeks bias ( Refractive index detector,RID) menunjukkan respon terhadap perubahan dari indeks
bias yang disebabkan cuplikan.
- Sensitifitas sangat rendah bila dibandingkan detektor lain.
- Peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir

Detektor Fluoresensi

- Digunakan untuk komponen –komponen yang berfluoresensi

- Kepekaan dan selektifitas cukup tinggi
- Banyak digunakan dalam analisis bahan cairan biologis karaena kepekaanya 100 kali lebih puka
daripada detektor UV-Vis

Detektor Elektrokimia

- Electrochemical detektor (ECD).

- Deteksi bergantung pada sifat hantaran molekul zat terlarut.
- - Detektor ini relatif selektif karena hanya dapat mendeteksi komponen polar
 Detektor Ionisasi Nyala

Pada setektor ionisasi nyala (Flame ionization detector,FID). Pelarut diuapkan setelah melewati kolom,
kemudian dilewatkan pada sumber lampu Ultraviolet dan nyala dideteksi.
Kelemahan detektor ini terletak pada batas deteksinya yang hanya sekitar 1 µg

Detektor hamburan cahaya evaporasi

Detektor hamburan cahaya evaporasi (evaporation light scattering detector, ELSD), pelarut diuapkan setelah
melawati kolom, kemudian kemudian komponen yang tersisa di evaporasi sebagai molekul partikel. Semua
komponen dapat dideteksi dengan detektor ini.

Detektor Radioaktif

Selektifitas tinggi karena hanya mendeteksi zat yang memeancarkan radiasi.

Detektor ini memiliki kemampuan besar untuk mengkaji nasib obat dan penimbunanan senyawa dalam hewan
percobaan.
Kelebihan KCKT
1. Pemasukan sampel yang tepat dan
mudah dikendalikan menjamin presisi
kuantitatif
2. Kolom dapat digunakan berkali-kali
3. Mudah dioperasikan secara otomatis
4. Dibandingkan dengan KG, terdapat
risiko penguraian sampel yang lebih
kecil karena pemanasan bukan
merupa-kan syarat dalam proses
kromatografi.
Kekurangan KCKT
1. Masih dibutuhkan detektor yang
terandalkan dan tidak mahal yang
dapat memantau senyawa-senyawa
yang tidak memiliki kromofor.
2. Obat-obat harus diekstraksi dari
formulasi sebelum dianalisis.
3. Terbentuknya buangan pelarut organik
dalam jumlah besar, yang mahal jika
dibuang.
.
 Penggunaan KCKT Dalam
Bidang Farmasi
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
merupakan suatu metoda pemisahan
canggih dalam analisis farmasi yang dapat
digunakan sebagai uji identitas, uji
kemurnian dan penetapan kadar

Pada Farmakope Indonesia Edisi IV Tahun

1995 sudah digunakan KCKT dalam analisis
kualitatif maupun kuantitatif dan uji
kemumian sejumlah 277 (dua ratus tujuh
puluh tujuh) obat/bahan obat
Penerapan kadar yang melibatkan teknik-teknik
KCKT yang lebih khusus

• Penetapan kadar injeksi adrenalin secara kromatografi

dengan senyawa pasangan ion anionik
• Penetapan kadar asam askorbat secara kromatografi
dengan senyawa pasangan ion kationik dan deteksi
elektrokimia
• Penetapan kadar protein dengan kemasan KCKT
berpori lebar
 2.
HPLC/ KCKT
Thank You