FIKSASI DAN PEWARNAAN

FIKSASI
 Fiksasi adalah suatu cara yang dilakukan untuk melekatkan sampel pada kaca objek,
sehingga tidak mudah lepas pada waktu dicuci apabila sediaan dicat
 Fiksasi digunakan untuk :
a. Melengn sampel pada objek glass dalam bentuk tetap, tidak berubah seperti aslinya
b. Mengawetkan sediaan
c. Mematikan organisme yang ada dalam sampel
d. Memudahkan bakteri atau sel mengambil warna
 Metode Fiksasi

 Dengan api Bunsen

Sediaan yang sudah kering dilewatkan perlahan-lahan pada nyala api spirtus 3 kali berturut-turut
 Dengan basa lemah
Methyl alcohol, aethyl alcohol, alcohol absolut, aether, formalin, dan aceton
Caranya : sediaan yang sudah kering digenangi dengan salah satu basa lemah diatas selama 3 menit
 Asam
Asam chromate 1%, asam pikrat, asam cuka (prosedur seperti nomor 2)
 Garam
Garam bikromat, slubtimat, dll (prosedur seperti nomor 2)

Catatan : pemilihan metode fiksasi dan cat yang tepat akan menghasilkan pengecatan yamg baik dam benar
 Jenis-jenis Pengecatan
 Pengecatan progresif
Disebut juga pengecatan direct atau monocromatik yaitu pengecatan yang menggunakan satu macam
cat saja, misalnya pengecatan sederhana. Perbedaan warna sel atau bagian sel tergantung dari besar
kecilnya kemampuan sel atau bagian sel menyerap warna yang diberikat. Cat yang digunakan :
solotio fuchsin, carbol fuchsin, solotio methylene blue, carbol gentian violet, dll.

 Pengecatan regresif
Disebut juga pengecatan contras atau indirect yaitu pengecatan yang menggunakan lebih dari satu
macam cat dan juga digunakan bahan-bahan peluntur. Contoh : pewarnaan gram, pewarnaan BTA,
dll

 Pengecatan majemuk
Adalah pengecatan yang dilakukan dengan satu campuran cat yang terdiri dari 2 atau 3 jenis cat
yang berlarut. Pada pengecatan ini bermacam-macam cat itu bekerja bersamaan terhadap sel,
jaringan, atau bagian-bagian sel sesuai dengan affinitinya masing-masing sehingga diperoleh hasil
yang berbeda. Contoh : wright, giemsa, kiewiet de young
 Cara-cara Pewarnaan
1. PENGECATAN SEDERHANA
2. PENGECATAN GRAM
3. PENGECATAN BTA MENURUT ZIEHL NEELSON
4. PENGECATAN BTA MENURUT KINYOUN GABBETT
5. PENGECATAN GRANULA METHACHROMATIS MENURUT NEISSER
6. PENGECATAN GRANULLA METHACHROMATIS MENURUT LOEFFLER
7. PENGECATAN GRANULLA METAHCHROMATIS MENURUT ALBERT &
CHRISTENSEN
8. PENGECATAN KAPSUL MENURUT BURRY GINS
9. PENGECATAN KAPSUL MENURUT MAC NEAL
10. PENGECATAN SPORA MENURUT WIRTZ CONKLIN
11. PENGECATAN SPORA MENURUT KLEIN
12. PENGECATAN FLAGELLA MENURUT LEIFSON
 Pewarnaan Gram
 Prinsip : berdasarkan perbedaan dinding sel atau peptidoglikan pada bakteri
 Tujuan : untuk mengetahui morfologi (bentu), susunan dan sifat bakteri
 Prosedur
a. Sediaan yang sudah difiksasi, digenangi dengan cat gram A selama 1-3 menit
b. Cuci dengan air sebentar
c. Genangi dengan cat gram B selama 1 menit
d. Cuci dengan air sebentar
e. Larutkan warnanya dengan menggenangi sediaan dengan cat gram C selama 30 detik,
sampai warna luntur
f. Cuci dengan air sebentar
g. Genangi dengan cat gram D selama 30 detik
h. Cuci dengan air sampai bersih, keringkan, amati dibawah mikroskop perbessaran 100
 Hasil pewarnaan :
Warna : merah atau ungu
Bentuk : bacil, coccus, spiral
Sifat : Gram + atau Gram -
Susunan : menyebar, diplo, strepto, staphy
Kesimpulan : Bakteri A

 Proses pengecatan
a. Pada pengecatan Gram A semua bakteri berwarna violet
b. Pada pengecatan Gram B terjadi perubahan yang tadinya berwarna violet berubah menjadi
violet tua-hitam
c. Pada pelunturan dengan Gram C, bakteri Gram + tetap berwarna violet sedangkan bakteri
Gram – menjadi tidak berwarna atau pucat
d. Pada pengecatan dengan Gram D, bakteri Gram + tetap berwarna violet sedangkan bakteri
Gram – akan berwarna merah oleh safranin didalam cat Gram D
 Pengecatan BTA Menurut Ziehl Neelson
 Cat yang digunakan :
a. ZN A
b. ZN B
c. ZN C

 Prosedur pengecatan :
a. Sediaan yang sudah difiksasi, diletakkan pada jembatan pengecatan, digenangi dengan ZN
A lewatkan nyala api spritus dibawah sediaan sampai selalu keluar uapnya tetapi jangan
sampai mendidih atau kering selama 5 menit
b. Cat dibuang dicuci dengan air mengalir
c. Larutkan warna merah pada sediaan sampai bersih dengan ZN B
d. Cuci dengan air mengalir
e. Genangi dengan ZN C selama 30 detik
f. Cuci dengan air mengalir dan keringkan
 Hasil pengecatan :
BTA berwarna merah
BTTA berwarna biru

 Proses pengecatan
a. Pada pengecatan dengan carbol fuchsin dan dipanaskan, selubung lemak pada BTA
terbuka, cat masuk kedalam badan bakteri. Bakteri yang tidak tahan asam dengan mudah
menyerap cat, dengan pemanasan atau tidak. Semua bakteri BTA atau BTTA berwarna
merah
b. Pada waktu dicuci dengan air, selubung lemak pada BTA akan tertutup kembali, sehingga
waktu dilarutkan dengan asam alcohol BTA tetap berwarna merah dan BTTA berwarna
pucat/jernih
c. Pada pengecatan dengan methylene blue, BTA tetap berwarna merah sedangkan BTTA
berwarna biru
 Pengecatan BTA menurut Kinyoun Gabbett
 Cat yang digunakan :
a. Cat Kinyoun
b. Cat Gabbett

 Prosedur pengecatan :
a. Sediaan yang sudah difiksasi digenangi dengan cat kinyoun selama 3 menit
b. Cuci dengan air mengalir
c. Genangi dengan cat gabbett selama 1 menit
d. Cuci dengan air mengalir sampai bersih. Keringkan amati dibawah mikroskop perbesaran 100x

 Hasil pengecatan
BTA berwarna merah
BTTA berwarna biru
 Proses pengecatan :
a. Pengecatan dengan cat kinyoun, semua bakteri berwarna merah. Masuknya cat fuchsin
kedalam badan bakteri tahan asam dipengaruhi oleh phenol, alcohol, dan tingginya kadar
cat
b. Pengecatan dengan gabbett terjadi 2 proses yaitu :
 Pelarutan warna merah dari fuchsin yang ada pada badan bakteri tidak tahan asam menjadi
pucat
 Pengecatan bakteri yang tidak tahan asam yang tadinya pucat menjadi biru
 Bakteri yang tahan asam tidak terpengaruh oleh cat gabbett sehingga warna tetap merah
 Pengecatan Granula Methachromatis menurut
Neisser
 Cat yang Digunakan :
a. Neisser A
b. Neisser B
c. Neisser C

 Prosedur pengecatan :
a. Sediaan digenangi dengan Neisser A selama 1 menit
b. Buang cat, genangi dengan Neisser B selama 10 detik
c. Buang cat, genangi dengan Neisser C selama 20-30 detik
d. Cuci dengan air mengalir, keringkan diudara, periksa pada mikroskop

 Hasil pengecatan
Granulla diujung badan bakteri berwarna biru oleh methylene blue dan badan bakteri berwarna kuning atau coklat
 Proses pengecatan :
a. Pada pengecatan dengan Neisser A, granula berwarna biru oleh methylene blue dan badan
bakteri berwarna biru muda
b. Dicuci dengan aquadest, granulla berwarna biru, badan bakteri tidak berwarna
c. Pengecatan dengan Neisser B, memberikan warna coklat atau kuning pada badan bakteri
 Pewarnaan Granula Metha chromatis menurut
Loeffler
 Cat yang digunakan : Loeffler Methylen Blue

 Prosedur pewarnaan :
a. Sediaan digenangi dengan cat loeffler methylene blue selama 1-2 menit
b. Cuci dengan aquadest
c. Keringkan diudara, periksa dengan mikroskop

 Hasil pengecatan :
Granula berwarna biru tua, badan bakteri berwarna biru muda

Catatan : granula pada badan bakteri seperti pentol korek api atau batang korek api
 Pengecatan Granula Methachromatis menurut
Albert&Christensen
 Cat yang digunakan :
a. Larutan toluidine biru
b. Larutan yodium
c. Larutan safranin

 Prosedur pewarnaan :
a. Sediaan digenangi dengan larutan toluidine selama 1 menit
b. Cuci dengan air mengalir
c. Dialiri dengan larutan yodium 1 menit
d. Cuci dengan air mengalir, isatkan
e. Genangi dengan larutan safranin O selama 1 menit
f. Cat dibuang, isatkan biarkan kering diudara
 Hasil pengecatan :
Granulla methachromatis berwarna hitam, badan bakteri berwarna merah
 Pengecatan Kapsul Bakteri menurut Burry
Gins
 Cat yang digunakan :
a. Tinta cina atau tinta india
b. Solotio fuchsin atau safranin

 Prosedur pengecatan :
a. Pada ujung sebelah kanan dari objek glass yang bersih dan bebas lemak, dibuat suspensi
bakteri dengan 1 ose air garam (NaCl/PZ)
b. Pada suspense itu ditambahkan 1 ose tinta cina, campur hingga homogeny
c. Dengan obyek glass yang lain campuran itu dibuat sediaan apus tipis
d. Biarkan kering diudara
e. Digenangi dengan solotio fuchsin selama 1 menit
f. Cat dibuang, sediaan dikeringkan diudara dengan posisi miring atau dengan kertas saring/tissue
 Hasil pengecatan :
Kapsul bakteri tidak berwarna badan bakteri berwarna merah latar belakang sedikit hitam

 Proses pengecatan :
a. Penambahan tinta cina pada suspense bakteri tidak akan memberi warna kebadan bakteri
dan kapsulnya tetapi memberi warna objek glassnya
b. Pengecatan dengan solotio fuchsin memberi warna merah pada badan bakteri sedangkan
kapsulnya tidak begitu pula latar belakangnya.
 Pengecatan Kapsul menurut Mac Neal
 Cat yang digunakan : Mac neal tetrachrome

 Prosedur pengecatan :
a. Buatlah sediaan yang tipis dari sampel yang akan diperiksa. Biarkan kering diudara
b. Genangi dengan Mac Neal Tetrachrome selama 3-5 menit
c. Cuci dengan aquadest, keringkan diudara periksa dengan mikroskop

 Hasil pengecatan :
Kapsul tidak berwarna atau pucat, badan bakteri berwarna merah-violet
 Pengecatan Spora menurut Klein
 Cat yang digunakan :
a. Ziehl Neelson A
b. Asam sulfat 1%
c. Ziehl Neelson C

 Prosedur pengecatan
a. Sediaan ditempatkan pada jembatan pengecatan
b. Genangi dengan ZN A sampai semua permukaan sediaan yang ada sampelnya tertutup dengan cat
c. Dibawah sediaan dilewatkan nyala api spirtus sampai keluar uapnya jangan sampai mendidih selama 5
menit
d. Cuci dengan air mengalir
e. Cuci dengan asam sufat 1% sampai sediaan kelihatan sedikit rose
f. Cuci dengan air mengalir
g. Genangi dengan ZN C selama 2 menit
h. Cuci dengan air mengalir sampai bersih, keringkan, periksa dibawah mikroskop
 Hasil pengecatan :
Spora bakteri berwarna merah, badan bakteri berwarna biru

 Proses pengecatan :
a. Pada pengecatan dengan ZN A semua bagian bakteri berwarna merah
b. Pencucian dengan asam sulfat melarutkan warna merah pada badan bakteri. Sedangkan
spora bakteri tetap berwarna merah (spora tahan asam)
c. Pengecatan dengan ZN C memberi warna biru pada badan bakteri, spora tetap merah
 Pengecatan Spora Bakteri menurut Wirtz
Conklin
 Cat yang digunakan :
a. Solotio malachiete green
b. Solotio safranin

 Prosedur pengecatan :
a. Sediaan tipis digenangi dengan solotio malachite green dan dipanasi sampai keluar uapnya selama 3-6
menit
b. Cuci dengan aquadest
c. Genangi dengan solotio safranin selama 30-60 detik
d. Cuci dengan aquadest
e. Keringkan periksa dengan mikroskop

 Hasil pengecatan :
Spora berwarna hijau badan bakteri berwarna kemerah-merahan
 Pengecatan Flagella menurut Leifson
 Cat yang digunakan :
a. Leifson A
b. Leifson B

 Prosedur pengecatan :
a. Kedalam 3-5 ml aquades didalam tabung reaksi, tambahkan 1 ujung ose koloni bakteri
yang diambil dari culture bakteri pada BHI agar/TS agar umur 18 jam 30 C, campur pelan-
pelan sampai homogeny
b. Teteskan 1 tetes suspense itu pada salah satu ujung objek glass, tegakkan pada raknya
sehingga terjadi hapusan dan biarkan kering diudara
c. Genangi dengan campuran cat tersebut diatas selama 5 menit sampai kelihatan kehijau-
hijauan pada ujung/teti tetesan. Jangan sampai kering
d. Cat dibuang, dicuci dengan air, keringkan dan lihat dengan mikroskop
 Hasil pengecatan :
Flagella dan bakteri berwarna merah
 TUGAS !!!!
1. Review materi hari ini pada buku
2. Carilah prinsip dari masing-masing pewarnaan (jika ada)
3. Tujuan dari masing-masing pewarnaan
4. Contoh bakteri Gram + dan Gram – berdasarkan bentuknya, sebanyak-banyaknya
5. Contoh bakteri dari masing-masing pewarnaan
6. Apa yang dimaksud dengan granula, spora, kapsul, dan flagella serta fungsinya
7. Sebutkan jenis-jenis spora dan flagella jelaskan dengan gambar
8. Jelaskan dengan gambar bagaimana bentuk granula dan kapsul pada bakteri

SELAMAT MENGERJAKAN!!!!!