Analisis Sperma

Gede Wira Buanayuda

Sumber WHO 2010
 1. Tahapan Analisis Sperma

Pada 5 menit awal

• Pemberian label identitas (usia, pekerjaan,
jenis kelamin, status dan lama menikah),
alamat, waktu/jam sampel ejakulat
dikeluarkan dan diterima
• Menempatkan wadah spesimen ejakulat pada
meja ruangan (suhu ruang) atau inkubator
dengan suhu 37oC untuk proses likuefaksi.
 Tahapan Analisis Sperma

Antara waktu 30-60 menit:

• Menilai proses likuefaksi dan penampilan umum semen.
• Mengukur volume semen.
• Mengukur pH semen.
• Mempersiapkan persiapan preparat basah untuk
penilaian mikroskopis seperti motilitas sperma dan
cairan pengencer (dilusi) yang dibutuhkan untuk
menghitung jumlah sperma.
• Menilai vitalitas sperma jika persentase sel sperma motil
rendah atau tidak motil tinggi.
 Tahapan Analisis Sperma

• Membuat pengecatan preparat sperma untuk menilai

morfologinya.
• Membuat pengenceran semen untuk menilai konsentrasi sperma.
• Menilai jumlah (konsentrasi) sperma.
• Melakukan tes mixed antiglobulin reaction (MAR) jika diperlukan.
• Menilai peroxidase-positive cells jika ada sel bulat ditemukan.
• Mempersiapkan spermatozoa untuk tes immunobead jika
diperlukan
• Melakukan sentrifugasi semen jika akan melakukan tes boikimia.
 Tahapan Analisis Sperma

Dalam kurun waktu 3 jam

• Mengirim sampel kebagian laboratrorium mikrobiologi
jika diperlukan
Setelah 4 jam.
• Finalisasi dan menilai morfologi hasil pengecatan preparat
sperma.
• Setelah 4 jam atau lebih pada hari yang sama atau pada
hari berikutnya jika sampel dibekukan.
• Menilai marker kelenjar asesoris jika diperlukan.
• Melakukan tes indirect immunobead jika diperlukan.
 2. Pengumpulan sampel

• Sampel harus dikumpulkan pada sebuah kamar

dengan privasi tersendiri dekat dengan laboratorium
• Jika sampel ejakulat dibawa dari luar laboratorium,
pemeriksaan sampel ejakulat tidak boleh > 1 jam
sejak ejakulasi terjadi
• puasa ejakulasi 2 hari dan maksimal 7 hari
• Perlu ditekankan bahwa sampel semen harus di ambil
lengkap sampai akhir ejakulasi dan melaporkan jika
ada sampel yang terbuang/tumpah saat pengambilan
 2. Pengumpulan sampel

• Sampel paling baik diperoleh dengan cara masturbasi

dan diejakulasikan pada wadah bersih bermulut lebar
terbuat dari kaca atau plastik yang telah dipastikan
tidak beracun untuk spermatozoa
• Menempatkan wadah spesimen ejakulat pada meja
ruangan (suhu ruang “20-37oC”) atau inkubator
dengan suhu 37oC untuk proses likuefaksi.
• Semua bahan sampel harus dianggap barang infeksius
yang kemungkinan mengandung kuman pathogen
seperti HIV, virus hepatitis, virus herpes dan lainnya
 3. Pemeriksaan makroskopis

• Analisis semen harus dimulai dengan inspeksi sederhana

segera setelah likuefaksi terjadi, biasanya sekitar 30
menit dan tidak lebih dari 1 jam setelah ejakulasi
• Periksa dan Catat Viskositas semen (Viskositas sampel
dapat dilakukan dengan menggunakan pipet plastic
sekali pakai dengan ujung lubang lebar (+/- diameter 1,5
mm) sehingga semen dapat jatuh akibat gaya tarik
grafitasi dan lakukan obeservasi terhadap sampel untuk
menetes/memanjang dari ujung lubang pipet)
• Periksa dan Catat warna, volume, pH semen
 4. Pemeriksaan mikroskopis

4.1 Pada awal pemeriksaan sampel pembesaran

mikroskop yang digunakan adalah 100x yang
merupakan kombinasi 10x lensa objektif dan 10x lensa
okuler. Pemeriksaan tersebut dengan pembesaran 100x
dapat memberikan informasi sampel sebagai berikut
• Pembentukan untaian lendir
• Agregasi atau aglutinasi sperma
• Adanya sel selain spermatozoa misalnya sel epithelial,
sel bulat (leukosit dan sel germinal imatur) dan kepala
sperma atau ekornya yang terisoloasi.
 4. Pemeriksaan mikroskopis

4.2 Pemeriksaan lanjutan dengan pembesaran

200x dan 400x dengan kombinasi lensa objektif
10x dan lensa okuler 20x atau 40x. Pembesaran
tersebut dapat memberikan informasi sebagai
berikut:
• Evaluasi motilitas sperma
• Penentuan pengenceran (dilusi) yang
dibutuhkan untuk penghitungan yang akurat
jumlah atau konsentrasi sperma.
 5. Membuat preparat basah

• Jika sampel semen telah homogen aliqout dapat diambil,

atau aduk terlebih dahulu agar menjadi homogen.
• Ambil aliqout semen sebanyak 10 ul dan taruh pada objek
glass dan tutup dengan cover glass ukuran 22 x 22 mm
(jika menggunakan cover glass ukuran 18 x 18 mm maka
aliqout yang digunakan sebanyak 6,5 ul) agar
kedalamannya 20 µm
• Periksa dan catat agregasi spermatozoa (agregasi
spermatozoa non spesifik merupakan keadaan melekat
antar spermatozoa immotil atau melekatnya spermatozoa
motil dengan untai lendir, sel non-sperma atau debris).
 5. Membuat preparat basah

• Aglutinasi spermatozoa (aglutinasi spermatozoa adalah keadaan

melekatnya spermatozoa motil satu dengan yang lainnya baik itu
perlekatan antara kepala-kepala sperma, ekor-ekor atau
kombinasinya)
• Derajat 1: isolated adalah ditemukan kurang dari 10 spermatozoa
peraglutinasi dan sangat banyak spermatozoa yang bebas.
• Derajat 2: moderate adalah ditemukan 10-50 spermatozo
peraglutinasi dan banyak spermatozoa bebas.
• Derajat 3: large adalah ditemukan lebih dari 50 spermatozoa
peraglutinasi dan hanya beberapa saja yang bebas.
• Derajat 4: gross: adalah semua spermatozoa mengalami aglutinasi
dan antara yang teragluitinasi satu sama lain saling terkoneksi.
 5. Membuat preparat basah

• Elemen sel selain spermatozoa (Ejakulat juga

mengandung sel selain dari spermatozoa dan beberapa
diantara sel tersebut mungkin memiliki arti klinis yang
bermakna. Sel lain tersebut bisa epithelial dari saluran
kemih, leukosit dan sel sperma/germinal yang imatur.
Leukosit dan sel germinal imatur disebut juga sel bulat,
dan bisa dibedakan dengan melakukan pengecatan
pada pembesaran 1000x atau dengan penambahan
tetesan ortotoluidin (OT) pada saat pembuatan
pengenceran untuk menghitung konsentrasi sperma).
 5. Membuat preparat basah

– Motilitas sperma
• Aduk dan ratakan sampel semen dengan baik
• Ambil aliquot dari semen tersebut segera setelah sampel semen teraduk merata,
agar tidak ada waktu untuk spermatozoa berpindah ke suspensi yang telah
mengendap kembali.
• Tetesan aliquot ditutup cover glass sesuai petunjuk sebelumnya, Apusan yang
dibuat dengan kedalaman 20 µm
• Tunggu hingga sampel aliquot menyebar merata ke seluruh lapisan cover glass
• Periksa preparat tersebut dengan optik fase kontras pada pembesaran 200x atau
400x.
• Lakukan pengamatan sistematis pada apusan tersebut untuk menghindari
observasi berulang pada area yang sama. Area yang diamati harus sering diganti-
ganti. Hindari memilih area pengamatan yang merupakan dasar area yang sama
dengan area pergerakan sperma yang dilihat (sebaiknya memilih area pengamatan
yang acak).
 5. Membuat preparat basah

Motilitas sperma
• Pada awalnya lakukan penilaian terhadap spermatozoa yang termasuk
kategori PR, setelah itu spermatozoa yang tergolong NP dan yang
terkahir dinilai adalah spermatozoa immotil pada lapang gerak atau kisi
yang sama. Seorang klinisi yang telah berpengalaman akan dengan
mudah menilai ketiga kategori tersebut secara bersamaan dan
melakukan penilaian pada area gerak yang lebih luas.
• Periksalah kurang lebih 200 spermatozoa per replika preparat yang
dibuat untuk menemukan persentase perbedaan kategori motilitasnya.
• Disaat bersamaan hitung jumlah spermatozoa per lapang pandang
/PLP(berguna untuk penentuan pengenceran saat menghitung
konsentrasi spermatozoa nanti) dan sel bulat PLP pada area yang sama.
 5. Membuat preparat basah

Catatan kategori motilitas sperma

• Motilitas progresif (PR): adalah spermatozoa yang
bergerak aktif baik itu yang bergerak lurus ataupun
berputar tanpa melihat kecepatan geraknya.
• Motilitas non-progresif (NP): adalah semua bentuk
pergerakan sperma selain progresif misalnya bergerak
melingkar pada area kecil, bergerak ditempat, hanya
bergetar saja atau hanya getaran ekor saja yang terlihat.
• Immotil: adalah tidak adanya pergerakan sperma
• lakukan penilaian hanya pada spermatozoa yang utuh
 5. Membuat preparat basah

– Vitalitas sperma
• Vitalitas sperma dapat diperiksa dengan
memperkirakan keutuhan membran
spermatozoa. Pemeriksaan vitalitas bisa
bagian dari analisis semen rutin tetapi
merupakan hal wajib yang diperiksa jika total
motilitas sperma (PR+ NP) kurang dari 50%.
 5. Membuat preparat basah

• Uji vitalitas dengan larutan eosin saja

• Metode ini sangat sederhana dan mudah dilakukan akan
tetapi preparat basah tidak dapat disimpan dan tidak dapat
digunakan sebagai alat kontrol kulalitas preparat lain.
• Menyiapkan reagen
• NaCl 0,9% (w/v): larutkan 0,9 g NaCl dalam 100 ml air steril
(jika ada NaCl 0,9% yang sudah dalam bentuk jadi dapat
langsung digunakan)
• Eosin Y, 0,5% (w/v): larutkan 0,5 g eosin Y (indeks warna
45380) dalam 100 ml 0,9% NaCl (jika ada Eosin Y 0,5%
dalam bentuk jadi dapat langsung digunakan)
 5. Membuat preparat basah

Prosedur pembuatan apusan eosin

• Aduk sampel hingga merata dengan baik
• Ambil aliquot sebanyak 5 µl dari semen dan
tambahkan dengan 5 µl larutan eosin pada
object glass. Campurkan kedua cairan terebut
dengan menggunakan ujung pipet dengan arah
melingkar pada object glass.
• Tutup dengan cover glass 22 x 22 mm dan
biarkan selama 30 detik.
 5. Membuat preparat basah

• Periksa setiap preparat yang dibuat terutama dengan

“negative-phase-contrast optics” karena jika dengan
“positive phase-contrast” maka akan sulit menilai
kepala yang berwarna merah mudah tipis. Lakukan
pengamatan pada pembesaran 200x atau 400x.
• Hitung jumlah kepala sperma yang terwarnai dan tidak
terwarnai dengan menggunkan alat bantu hitung
• Lakukan evaluasi terhadap 200 spermatozoa
• Laporkan rata-rata persentase spermatozoa vital ke
jumlah bilangan terdekat
 5. Membuat preparat basah

• Standar Penilaian eosin

• Spermatozoa hidup memiliki tampilan kepala putih dan
merah muda tipis (light pink) dan spermatozoa mati
memiliki tampilan kepala berwarna merah atau merah
muda gelap (dark pink).
• Jika pewarnaan hanya tampak pada bagian leher dan sisa
bagian kepala tidak terwarnai maka disimpulkan sebagai
membran leher yang tidak utuh (leaky neck membrane)
bukan sebagai spermatozoa mati ataupun disintegrasi
total dari membran. Spermatozoa tersebut disimpulkan
hidup.
 5. Membuat preparat basah

5.2.2 Uji vitalitas dengan metode hypo-osmostic

swelling (HOS).
• Uji ini merupakan alternatif terhadap uji
sebelumnya. Uji ini sangat berguna pada saat
pewarnaan harus dihindari misalnya pada saat
memilih spermatozoa untuk dilakukan ICSI.
Spermatozoa dengan membran yang utuh akan
mengalami edema dalam kurun waktu 5 menit pada
medium hipo-osmosis dan semua bentuk flagella
akan terstabilisasi dalam kurun waktu 30 menit
 5. Membuat preparat basah

• Menyiapkan reagen untuk HOS

• Larutan edema untuk tujuan diagnsosis:
larutkan 0,735 g sodium citratedihydrate dan
1,351 g D-fructose dalam 100 ml air steril.
Bekukan 1 ml aliquot pada larutan tersebut
dengan suhu -20oC.
• Untuk tujuan terapi: larutkan medium yang
akan digunakan pada air steril dengan
perbandingan 1+1 (1:2).
 5. Membuat preparat basah

Prosedur hos
• Cairkan larutan edema beku dan aduk hingga
merata baik
• Hangatkan 1 ml larutan edema (tujuan
diagnostis) atau 1 ml medium (tujuan terapi)
didalam microsentrifuge tube pada suhu 37oC
selama 5 menit.
• Aduk sampel ejakulat hingga merata
• Ambil 100 µl aliquot dari semen dan tambahkan
larutan edema yang telah dibuat. Aduk
perlahan dengan arah kedalam dan keluar dari
pipet
• Inkubasi pada suhu 37oC selama 5 menit setelah
itu pindahkan 10 µl aliquot ke object glass dan
tutup dengan cover glass ukuran 22 x 22 mm.
• Lakukan pemeriksaan apusan dengan optik fase
kontras dengan pembesaran 200x atau 400x.
• Hitung jumlah sperma yang tidak mengalami
edema (mati) dan yang edema (hidup) dengan
alat bantu hitung.
• Lakukan penilaian terhadap 200 spermatozoa
pada apusan yang dibuat
• Laporkan rata-rata persentase spermatozoa vital
ke jumlah bilangan terdekat
• Standar Penilaian hos
• Spermatozoa yang edema diidentifikasi dengan
adanya perubahan bentuk sperma seperti
terlihatnya ekor yang melengkung (coil)
• Spermatozoa hidup dibuktikan dengan adanya
ekor yang melengkung tersebut dan hitung
semua bentuk spermatozoa yang memiliki ekor
melengkung ataupun tidak
 6. Jumlah spermatozoa

• Konsentrasi sperma dihitung dengan

menggunakan improved Neubauer
haemocytometer atau Makler
 6.1 Untuk penggunaan improved Neubauer haemocytometer

• Langkah awal adalah membuat larutan pengencer menggunakan

NaCl 0,9% 7 ml, ditambahkan larutan OrthoToluidine (OT) dan larutan
H2O2
• Faktor dilusi ditentukan oleh jumlah spermatozoa pada penghitungan
per lapang pandang dengan pembesaran 400x, sebagai contoh jika
15-40 spermatozoa PLP maka pengencerannya adalah 1:10 (1+9),
>40-200 spermatozoa PLP pengencerannya adalah 1:20 (1+19), jika <
15 spermatozoa PLP maka pengencerannya 1:2 (1+1)
• Contoh sampel ejakulat disedot dengan mikropipet dengan jumlah
sesuai dengan faktor pengencerannya (misal 1:20) maka 5 μl semen
yang likuefaksi ditambahkan dengan 95 μl larutan pengencer diaduk
rata dengan mikropipet
• Keluarkan cairan semen yang sudah dicampur
dengan pengencer tadi dengan mikropipet
menuju kamar hitung ImprovedNeubauer secara
perlahan hingga memenuhi ruang secara merata
• Amati dan hitung pada pembesaran 400x,
dimana hanya spermatozoa yang lengkap
(kepala dan ekor) yang dihitung
• Spermatozoa dihitung berdasarkan lokasi
kepalanya dalam kotak.
• Batas kotak pada area hitung ditandai oleh garis
ditengah dari tiga garis pada tepi area hitung tersebut,
sehingga spermatozoon dihitung jika sebagain besar
kepalanya terletak diantara dua garis yang terletak di
bagian dalam. Spermatozoon yang dapat dihitung jika
sebagian besar kepalanya terletak pada bagian garis
batas bawah atau kiri tengah yang berbentuk huruf “L”
• Disarankan menghitung minimal 200 Spermatozoa pada
area hitung neubauer. Hitung jumlah spermatozoa, sel
lainnya jika ada (misal leukosit) pada kamar hitung.
• Nilai dihitung dengan rumus, konsentrasi (K) = (N/n) × (1/20) ×
faktor pengenceran. (Banyaknya spermatozoa yang dihitung (N),
total jumlah baris yang dievaluasi pada kamar hitung (n), (1/20) =
angka 20 didapat dari volume tiap baris pada area hitung 4, 5, 6),
atau konsentrasi (K) = (N/n) × (1/25) × faktor
pengenceran(Banyaknya spermatozoa yang dihitung (N), total
jumlah baris yang dievaluasi pada kamar hitung (n), (1/25) = angka
25 didapat dari volume tiap baris pada kamar atau area hitung
1,2,3,7,8, 9)
• Contoh, untuk pengenceran dengan perbandingan 1:20 (1+19)
dengan menggunakan salah satu area hitung 4,5, atau 6 maka
konsentrasinya (K) adalah = (N/n) × (1/20) × 20 spermatozoa/nl; K =
(N/n) × (1/20) x 20 x 106 spermatozoa/ml.
• Contoh, untuk pengenceran dengan
perbandingan 1:2 (1+1) dengan menggunakan
salah satu area hitung 1,2,3,7,8 dan 9 maka
konsentrasinya (K) adalah = (N/n) × (1/25) × 2
spermatozoa/nl; K = (N/n) × (1)
spermatozoa/nl; (K) = (N/n) × (1) x 106
spermatozoa/ml
• Misal ditemukan 210 spermatozoa pada kamar
hitung no 9 dengan pengenceran 1:10 maka K jt/ml
= (N/n) × (1/25) × 10 x 106, K = 210/4 x 1/25 x 10 x
106 = 21 jt/ml.
• Atau secara mudah K (jt/ml) = jumlah spermatozoa
yang dihitung pada satu kamar hitung (kamar/area
hitung 1-9) x 10.000 x Faktor Pengenceran, misal
ditemukan 210 spermatozoa pada kamar hitung no
9 dengan pengenceran 1:10 maka K = 210 x 10.000 x
10 adalah 21 jt/ml
 7. Penghitungan jumlah leukosit

• Penghitungan konsentrasi leukosit dilakukan bersamaan dengan penghitungan

konsentrasi spermatozoa menggunakan improved Neubauer haemocytometer.
• Langkah pertama adalah membuat larutan pengencer menggunakan NaCl 0,9%
7 ml, ditambahkan larutan OrthoToluidine dan larutan H2O2.
• Faktor dilusi ditentukan oleh jumlah spermatozoa pada penghitungan per
lapang pandang dengan pembesaran 400x.
• Perbandingan pengenceran yang digunakan sama dengan saat menghitung
konsentrasi spermatozoa pada bahasan sebelumnya.
• Keluarkan cairan semen yang sudah dicampur dengan pengencer menuju
kamar hitung ImprovedNeubauer secara perlahan hingga memenuhi ruang
secara merata.
• Amati dan hitung pada pembesaran 400x dimana inti leukosit tampak
berwarna coklat dengan pewarnaan ortho toluidine. Penghitungan leukosit
menyesuaikan pada saat menghitung konsentrasi spermatozoa bahasan
 8. Pengecatan (Morfologi spermatozoa)

• Siapkan 2 objek glas yang bersih

• Berikan identitas pada objek glass yang akan
dilakukan pengecatan
• Teteskan 10 µl aliquot pada objek glass
kemudian lakukan dorongan dengan objek
glass yang satunya lagi dengan kemiringan
sudut 450 dan biarkan apusan mengering.
• Lakukan pengecatan
 8.1 Papanicolaou

• Siapkan bahan berupa set cat papanicolaou

dan Ethanol 50%, 80%, 95% dan 100%
• Lakukan langkah-langkah sebagai berikut
dengan mencelupkan apusan spermatozoa
yang telah dibuat sebelumnya
1. Ethanol 80% (v/v) 30 seconds 10. Ethanol 95% (v/v) At least 15
2. Ethanol 50% (v/v) 30 seconds minutes
3. Purified water 30 seconds 11. G-6 orange stain 1 minute
4. Harris’s haematoxylin 4 12. Ethanol 95% (v/v) 30 seconds
minutes 13. Ethanol 95% (v/v) 30 seconds
5. Purified water 30 seconds 14. Ethanol 95% (v/v) 30 seconds
6. Acidic ethanol 4–8 dips* 15. EA-50 green stain 1 minute
7. Running cold tap water 5 16. Ethanol 95% (v/v) 30 seconds
minutes 17. Ethanol 95% (v/v) 30 seconds
8. Ethanol 50% (v/v) 30 seconds 18. Ethanol 100% 15 seconds
9. Ethanol 80% (v/v) 30 seconds 19. Ethanol 100% 15 seconds
• Setelah kering lakukan penghitungan
morfologi terhadap minimal 200 spermatozoa
dengan pembesaran 1000x
• Hitung presentase morfologi normal
spermatozoa.